COVID-19

RT-PCR a antigénové testy nefungujú na zistenie infekcie COVID-19 (kompletný rozbor)

Skutkový stav

Vláda Slovenskej republiky uznesením č. 587 z 30. septembra 2020, uverejneným v Zbierke zákonov Slovenskej republiky pod č. 268/2020 Z. z., schválila návrh na vyhlásenie núdzového stavu podľa čl. 5 ústavného zákona č. 227/2002 Z. z. o bezpečnosti štátu v čase vojny, vojnového stavu, výnimočného stavu a núdzového stavu v znení neskorších predpisov, a dňom
1. októbra 2020 vyhlásila na obdobie 45 dní na postihnutom území Slovenskej republiky núdzový stav.

Z nami vykonaného šetrenia vyplýva, že štátne orgány v čase vyhlásenia núdzového stavu ani len nepoznali, a doposiaľ ani nepoznajú, skutočný stav situácie na území SR v súvislosti s pandémiou ochorenia COVID-19. Svedčí o tom fakt, že všetky štatistiky SR ohľadom predmetného ochorenia sú vypracovávané na základe výsledkov testovania populácie RT-PCR testami. Kompetentné orgány štátnej správy pritom nemajú informácie o parametroch uvedených testov.

Dňa 16.11.2020 sme požiadali Úrad verejného zdravotníctva SR, Ministerstvo zdravotníctva SR a Štátny ústav pre kontrolu liečiv, aby nám zodpovedalo základné otázky ohľadne parametrického nastavenia používaných RT-PCR testov. Ministerstvo a aj jeho Úrad v predmetnej veci na seba navzájom odkázali v ten istý deň. Ústav nás odkázal na stránku, kde okrem všeobecných informácií, nie je uvedené nič, na čo sme sa pýtali.

Predmetom našich otázok pritom bolo zodpovedanie základných skutočností, od ktorých je možné odvíjať relevanciu výsledkov RT-PCR testov vo vzťahu k detekcii ochorenia COVID-19. Zodpovedanie predmetných otázok je teda predpokladom na vyvodenie záveru o vhodnosti použitia RT-PCR testov na zisťovanie prítomnosti ochorenia COVID-19 u testovaného a na jeho potenciálnu možnosť prenosu tohto ochorenia na ďalšie osoby.

Predmetom našich otázok teda bolo, čo konkrétne RT-PCR test testuje, aby sme vylúčili, že testuje, čo testovať nemá, a najmä na koľko cyklov je nastavený, aby sme vedeli posúdiť jeho presnosť. Ani jeden z horeuvedených štátnych orgánov však takýmito informáciami nedisponuje, v opačnom prípade nám ich v rozpore so zákonom č. 211/2000 Z. z. neposkytol.

Inými slovami, štátne orgány SR na úseku verejného zdravia asi iba tušia, čím sa obyvateľstvo SR testuje, a čo sa testuje, avšak bez vedeckého základu. Nevedia teda vôbec vyhodnotiť funkčnosť, či použiteľnosť RT-PCR testov, ani ich mieru falošnej pozitivity, a ani to, čo vlastne testujú. Nariadenie povinného plošného testovania takýmito testami je teda v úplnom rozpore s platným právnym stavom a medzinárodnými záväzkami SR.

Ak pritom RT-PCR testy nie sú vhodnými testami na zisťovanie prítomnosti ochorenia COVID-19 u testovaného a na jeho potenciálnu možnosť prenosu tohto ochorenia na ďalšie osoby, potom ani výsledky testovania predmetnými testami nemôžu byť relevantným základom pre vyhlásenie núdzového stavu, t. j. na základe predmetných výsledkov nemožno vyvodiť záver o splnení predpokladu na vyhlásenie núdzového stavu (napr. že došlo k takému rozšíreniu ochorenia, ktorého rozsah by bolo možné považovať za pandémiu). 

Nedostatočné požiadavky na uskutočňovanie klinického hodnotenia zdravotníckych prostriedkov a na hodnotenie funkčnej spôsobilosti diagnostických zdravotníckych prostriedkov in vitro

Európske centrum pre prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC) uverejnilo na svojom webovom sídle nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom „Regulačný rámec EÚ pre diagnostické testy“:

„Činidlá, kontrolné materiály, testovacie súpravy a nástroje určené na lekárske použitie sa označujú ako diagnostické zdravotnícke pomôcky in vitro (IVD) 1. V súčasnosti platným legislatívnym rámcom pre tieto zariadenia na úrovni EÚ je smernica 98/79 /ES. Pri uvádzaní zariadenia na trh EÚ musí výrobca preukázať zhodu s príslušnými zákonnými požiadavkami smernice. To zahŕňa aj vykonanie vyhodnotenia presnosti zariadenia. Keď výrobca deklaruje zhodu zariadenia s právnymi požiadavkami, môže na zariadenie umiestniť označenie CE a umiestniť ho na trh. Označenie CE je teda väčšinou založené na sebahodnotení a vlastnom vyhlásení výrobcu testu vrátane tvrdení o zhode zariadenia s právnymi požiadavkami, na ktoré musí mať výrobca príslušnú technickú dokumentáciu a štúdie na podporu týchto tvrdení.

Nezávislé informácie o klinickom výkone týchto testov, pokiaľ ide o citlivosť a špecifickosť, sú často obmedzené, a napriek tomu sú pre správnu interpretáciu výsledkov rozhodujúce. Toto je obzvlášť nebezpečné v súvislosti s rozvíjajúcou sa pandémiou. Vo svojom oznámení z 15. apríla a v najnovšom odporúčaní z 18. novembra Komisia odporučila členským štátom, aby pred zavedením pomôcok do klinickej praxe vykonali ich validačné štúdie. Od 26. mája 2022 bude smernica nahradená nariadením (EÚ) 2017/7465. Týmto nariadením sa posilnia požiadavky na dôkazy o funkčnosti testovacej pomôcky a zavedie sa dôkladné hodnotenie testov COVID-19 dotknutými orgánmi, vrátane rýchlotestov na antigén.“

Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) uverejnila na svojom webovom sídle dňa 11.9.2020 nasledujúci článok:

„Veľmi málo antigénových rýchlotestov na SARS-CoV-2 prešlo prísnou regulačnou kontrolou. Iba štyri testy obdržali povolenie k núdzovému použití (EUA) od amerického Úradu pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) a ďalšie dva testy boli schválené Japonskou agentúrou pre farmaceutické a lekárske prístroje. Iba tri spoločnosti predložili WHO dokumenty za účelom zaradenia ich testov na Emergency Use Listing (EUL). Údaje o citlivosti a špecificite aktuálne dostupných antigénových rýchlostestov pre SARS-CoV-2 boli odvodení zo štúdií, ktoré sa líšia dizajnom a hodnotenými značkami testov.“

ECDC aj WHO sa teda zhodli, že na trhu sa objavilo množstvo nových testov na COVID-19, ich výrobcovia pritom musia udať iba tie najnutnejšie informácie (názov, účel použitia, bezpečnosť, ochrana životného prostredia, a pod.), avšak údaje o klinickej senzitivite a špecificite týchto testov zatiaľ chýba. Tieto údaje overuje Iniciatíva Svetovej zdravotníckej organizácie FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics), ktorá zhromažďuje údaje z vedeckých článkov a v máji 2022 by malo byť vydané nové nariadenie EÚ s prísnejšími podmienkami. Členským štátom zatiaľ iba odporučili, aby pred uvedením zariadenia na trh uskutočnili validačné štúdie testov. Podobne aj FDA vydáva Emergency Use Authorization s miernejšími požiadavkami na výrobcu testov.

Český Státní úřad pro kontrolu léčiv uviedol:

„Zdravotnický prostředek, který je nově uváděn na trh, musí být notifikován nejpozději do 15 dnů ode dne jeho uvedení na trh. Toto platí jak pro výrobce a zplnomocněné zástupce (§ 31 zákona č. 268/2014 Sb.), tak pro distributory a dovozce (§ 33 zákona č. 268/2014 Sb.).

Na vedeckom základe nemohol byť zostavený jediný test bez ohľadu na to, či PCR, alebo antigénový, pretože k dnešnému dňu neexistuje jediná vedecká publikácia, v ktorej by bolo overiteľným spôsobom doložené, že vírusové častice SARS-CoV-2 boli vyčistené a izolované pomocou centrifugácie s hustotným gradientom, v ktorom by izolácia bola preukázaná fotografiou z elektrónového mikroskopu skoncentrovaných izolovaných častíc, bielkoviny boli biochemicky analyzované, z takto izolovaných častíc bola vyextrahovaná molekula RNA, gélovou elektroforézou zmeraná jej veľkosť a sekvenovaním štandardne dlhých sekvencií zostavený jej reťazec.

V zmysle uvedeného je nevyhnutným záverom, že všetky údaje o citlivosti alebo špecificite, ako PCR testov, tak antigénových testov, nemajú žiadnu výpovednú hodnotu. Uvedené preukazuje aj nasledujúca citácia dôvodovej správy k platnému českému zákonu č. 268/2014 Sb. z ktorej je zrejmé, že požiadavky na uskutočňovanie klinického hodnotenia zdravotníckych prostriedkov a na hodnotenie funkčnej spôsobilosti diagnostických zdravotníckych prostriedkov in vitro, sú v aktuálne platnom zákone č. 268/2014 Sb. vymedzené absolútne nedostatočne:

Přestože je klinické hodnocení v procesu posuzování shody do značné míry podceňováno či dokonce opomíjeno, jedná se o jeden z nejdůležitějších kroků tohoto procesu, neboť jeho výsledky ověřují klinickou účinnost a bezpečnost zdravotnických prostředků, která je dána interakcí s tělem pacienta. Nejedná se tedy o pouhou obecnou bezpečnost a funkčnost vycházející z technických parametrů. Nebezpečný může být totiž i takový výrobek, který pacientovi nijak přímo neublíží, ale neprovádí správně diagnostiku, na základě které by se zvolila adekvátní léčba. Nebezpečí tak může spočívat v omisivním chování poskytovatele zdravotních služeb nejednajícím s odkazem na diagnostiku nefungujícím zdravotnickým prostředkem, ze které nevyplývala nutnost patřičného zásahu.

V aktuálním legislativním ošetření této oblasti jsou velké nedostatky, které spočívají zejména ve značné roztříštěnosti jednotlivých vzájemně souvisejících ustanovení, jež by měla být soustředěna do jednoho právního předpisu, a taktéž v absenci stanovení některých esenciálních požadavků (např. kdo smí provádět klinické hodnocení). Zákon o zdravotnických prostředcích je přitom na úrovni zákona jediným předpisem, kterému věcně přísluší úprava klinického hodnocení.

Hodnocení funkční způsobilosti diagnostických zdravotnických prostředků in vitro je svým významem v procesu posuzování shody rovnocenné s klinickým hodnocením. Tímto hodnocením se ověřuje diagnostická schopnost diagnostických zdravotnických prostředků in vitro, především parametry specificity, senzitivity, přesnosti a reprodukovatelnosti.

Na základě výsledků získaných pomocí diagnostických zdravotnických prostředků in vitro se stanovuje následná diagnóza a léčba pacienta. Je tedy zřejmé, že nedostatečné ověření funkční způsobilosti u diagnostických zdravotnických prostředků in vitro může vést k poškození zdraví pacientů a následnému finančnímu zatížení celého zdravotního systému.

Dosavadní zkušenosti s procesem hodnocení funkční způsobilosti jsou mnohem méně uspokojující, než jaké jsou u klinického hodnocení, a to i s ohledem na velmi nedostatečnou právní úpravu této oblasti. Stejně jako u klinického hodnocení není legislativně stanoveno, kdo je odborně způsobilý provádět hodnocení funkční způsobilosti diagnostických zdravotnických prostředků in vitro, co může být považováno za referenční materiál, co je závěrečnou zprávou tohoto hodnocení, jaké má náležitosti, atp.

Výše uvedené nedostatky stávajícího zákona vedou k nepochopení procesu klinického hodnocení a hodnocení funkční způsobilosti, jejich důležitosti a nepostradatelnosti ze strany adresátů právní regulace. Tento problém vychází z dlouhodobě prosazované koncepce, která zcela opomíjela skutečnost, že zdravotnické prostředky jsou společně s léčivými přípravky primárními produkty nezbytnými pro realizaci moderní medicíny. Vysoké nároky na klinickou účinnost jsou tedy naprosto legitimním požadavkem.“

Z citovanej dôvodovej správy vyplýva, že české Ministerstvo zdravotníctva si plne uvedomuje, že aktuálna legislatíva umožňuje uviesť do praxe aj testy, ktoré môžu byť ľuďom zdraviu nebezpečné. Podobné závery platia aj pre Slovenskú republiku. Vzhľadom na aktuálne platnú legislatívu v Slovenskej republike nie je pred uvedením testov ako zdravotníckej pomôcky do praxe nevyhnutné vykonať kompetentnými orgánmi Slovenskej republiky vlastné klinické hodnotenie predmetných testov ako zdravotníckych prostriedkov, ani hodnotenie ich funkčnej spôsobilosti ako diagnostických zdravotníckych prostriedkov in vitro.

V zmysle ustanovenia § 2 ods. 19 zákona č. 362/2011 Z. z. o liekoch a zdravotníckych pomôckach a o zmene a doplnení niektorých zákonov, v platnom znení (ďalej len „Zákon o liekoch“): „Diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro je zdravotnícka pomôcka, ktorá je

a)  činidlom, reagenčným výrobkom, kalibračným materiálom, kontrolným materiálom alebo ich súpravou, nástrojom, prístrojom alebo systémom použitým samostatne alebo v kombinácii, určená výrobcom na hodnotenie in vitro vzoriek pochádzajúcich z ľudského tela vrátane darovanej krvi alebo tkaniva, najmä na účely poskytnutia informácie

1.  týkajúcej sa fyziologického alebo patologického stavu,

2.  týkajúcej sa vrodenej chyby,

3.  umožňujúcej určiť bezpečnosť a znášanlivosť s možným príjemcom,

4.  umožňujúcej kontrolovať terapeutické opatrenia,

5.  umožňujúcej samodiagnostiku neodborníkom v domácom prostredí, alebo

6.  umožňujúcej hodnotenie funkčnosti diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro,

b)  nádobou na vzorky bez ohľadu na to, či je vákuového typu alebo nie, špecificky určenou výrobcom na priamy odber vzorky pochádzajúcej z ľudského tela a na jej uchovávanie pre diagnostickú skúšku in vitro,

c)  výrobkom určeným na všeobecné použitie v laboratóriu, ak bol vzhľadom na svoje charakteristické vlastnosti špecificky určený výrobcom na diagnostické skúšky in vitro,

d)  príslušenstvom diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro, ktoré je špecificky určené výrobcom na použitie spolu s diagnostickou zdravotníckou pomôckou in vitro v súlade s jej účelom určenia, okrem invazívnych zdravotníckych pomôcok určených na odber vzoriek a zdravotníckych pomôcok prichádzajúcich do priameho styku s ľudským telom, určených na získanie vzorky z ľudského tela.“V zmysle ustanovenia § 73a písm. b) Zákona o liekoch: „Poskytovateľ zdravotnej starostlivosti je povinný zabezpečiť, aby zdravotnícki pracovníci v zdravotníckom zariadení, ktoré prevádzkuje, pri poskytovaní zdravotnej starostlivosti používali len (…) b) zdravotnícku pomôcku a diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro, ktorá spĺňa požiadavky na uvedenie na trh v súlade s účelom určenia a návodom na použitie.“

V zmysle ustanovenia § 110 ods. 5 Zákona o liekoch: „Štátny ústav po registrácii výrobcu podľa odsekov 2 a 3 alebo po prijatí oznámenia výrobcu podľa odseku 4 pridelí diagnostickej zdravotníckej pomôcke in vitro kód. Štátny ústav priebežne vedie, kontroluje a aktualizuje databázu diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro; ak diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro už nespĺňa požiadavky na uvedenie na trh alebo na uvedenie do prevádzky, štátny ústav tejto diagnostickej zdravotníckej pomôcke in vitro zruší registráciu formou rozhodnutia alebo vypustí diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro z databázy zdravotníckych pomôcok a písomne o tom informuje výrobcu alebo splnomocnenca. Po nadobudnutí právoplatnosti rozhodnutia o zrušení registrácie alebo vypustení diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro z databázy zdravotníckych pomôcok štátny ústav zruší kód pridelený štátnym ústavom. Štátny ústav poskytuje v elektronickej podobe údaje z databázy zdravotníckych pomôcok národnému centru.“

V zmysle ustanovenia § 110 ods. 6 a 7 Zákona o liekoch: „(6) Ak je diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro, ktorá má značku zhody pri zaregistrovaní podľa odseku 2, novým výrobkom, výrobca to uvedie v oznámení štátnemu ústavu. Na základe tohto oznámenia výrobca v priebehu nasledujúcich dvoch rokov predkladá štátnemu ústavu každé dva mesiace správu o získaných skúsenostiach vzťahujúcich sa na diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro po jej uvedení na trh. (7) Diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro sa považuje za novú, ak je určená na

a)  analyzovanie novej látky alebo hodnotenie novej veličiny a nebola zabezpečená sústavná dostupnosť diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro na trhu Slovenskej republiky počas predchádzajúcich troch rokov,

b)  použitie analytického postupu, ktorý sa v Slovenskej republike nepoužíval nepretržite počas predchádzajúcich troch rokov.“

V zmysle ustanovenia § 110a Zákona o liekoch: „(1)Revidovaný regulačný rámec pre zdravotnícke pomôcky upravuje osobitný predpis.[1] (2) Autorizáciu notifikovaných osôb, notifikáciu notifikovaných osôb, plnenie informačných povinností vo vzťahu ku Komisii a členským štátom, ktoré vykonáva členský štát podľa osobitných predpisov, vykonáva Úrad pre normalizáciu, metrológiu a skúšobníctvo Slovenskej republiky (ďalej len „úrad“). Úrad je orgánom zodpovedným za notifikované osoby. (3) Štátny ústav (pre kontrolu liečiv) vykonáva

a)  registráciu distribútorov zdravotníckych pomôcok sprístupňujúcich zdravotnícke pomôcky,

b)  kontrolu vložených údajov v elektronickom systéme registrácie výrobcov, splnomocnených zástupcov, dovozcov,

c)  plní úlohy členského štátu podľa osobitného predpisu pri

1.  klinickom skúšaní zdravotníckych pomôcok,

2.  dohľade nad bezpečnosťou zdravotníckych pomôcok,

3.  výkone trhového dohľadu nad zdravotníckymi pomôckami,

4.  spolupráci medzi členskými štátmi a pri výmene informácií.“V zmysle ustanovenia § 112 ods. 1 a 2 Zákona o liekoch: „(1) Diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro možno uviesť na trh alebo uviesť do používania, ak po jej správnom inštalovaní, udržiavaní a používaní podľa jej účelu určenia neohrozí bezpečnosť a zdravie pacientov, používateľov alebo iných osôb. (2) Počas veľtrhov, výstav a prezentácií možno predvádzať diagnostické zdravotnícke pomôcky in vitro, ktoré nezodpovedajú požiadavkám, ktoré sú uvedené v tomto zákone a v osobitných predpisoch, ak je to na viditeľnom paneli zreteľne uvedené spolu s upozornením, že tieto diagnostické zdravotnícke pomôcky in vitro možno uviesť na trh alebo uviesť do používania, ak sa splnia požiadavky uvedené v tomto zákone a v osobitných predpisoch.“

V zmysle ustanovenia § 112 ods. 3 až 5 Zákona o liekoch: „(3) Zakazuje sa uvádzať na trh ortuťové teplomery, ktoré sú určené na meranie telesnej teploty, a sfygmomanometre určené širokej verejnosti. (4) Štátny ústav písomne požiada Komisiu o prijatie potrebných opatrení, ak a) postup posudzovania zhody diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro alebo skupiny diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro je nevhodný, b) je potrebné rozhodnutie o tom, či posudzovaný výrobok alebo skupina výrobkov zodpovedá požiadavkám na diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro. (5) Výrobca diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro je oprávnený dodávať diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro, za ktorej uvedenie na trh zodpovedá, nemocničným lekárňam, verejným lekárňam, výdajniam zdravotníckych pomôcok, zdravotným poisťovniam a pacientom; nie je oprávnený účtovať cenu obchodného alebo sprostredkovateľského výkonu.“

V zmysle ustanovenia § 117 ods. 3 Zákona o liekoch: „Poskytovateľ zdravotnej starostlivosti je povinný pri poskytovaní zdravotnej starostlivosti používať zdravotnícke pomôcky alebo diagnostické zdravotnícke pomôcky in vitro v súlade s účelom určenia, ktorý bol predmetom posudzovania zhody na účely overenia, či spĺňajú požiadavky na uvedenie na trh alebo na uvedenie do prevádzky.“

V zmysle ustanovenia § 129 ods. 2 písm. e) Zákona o liekoch: „Štátny ústav (…) e) vydáva

1.  posudok na materiálne a priestorové vybavenie a personálne zabezpečenie,

2.  rozhodnutie o registrácii humánnych liekov,

3.  povolenie na klinické skúšanie humánneho lieku a zdravotníckej pomôcky a dohliada nad jeho vykonávaním,

4.  osvedčenie o dodržiavaní požiadaviek správnej výrobnej praxe, osvedčenie o dodržiavaní požiadaviek správnej veľkodistribučnej praxe a osvedčenie o splnení požiadaviek uvedených v Európskom liekopise podľa § 126 ods. 11,

5.  stanovisko k žiadosti o povolenie očkovacej kampane,

6.  povolenie na výrobu humánnych liekov, povolenie na výrobu skúšaných humánnych produktov a skúšaných humánnych liekov a povolenie na veľkodistribúciu humánnych liekov (…).“

V zmysle ustanovenia § 138 ods. 20 Zákona o liekoch: „Poskytovateľ zdravotnej starostlivosti sa dopustí iného správneho deliktu, ak

b)  pri poskytovaní zdravotnej starostlivosti nezabezpečí, aby zdravotnícki pracovníci používali len

zdravotnícku pomôcku a diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro, ktorá spĺňa požiadavky na uvedenie na trh v súlade s účelom určenia a návodom na použitie (…).“

  • V zmysle ustanovenia § 143j ods. 6 Zákona o liekoch: „Ustanovenia upravujúce správne delikty pre diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro v § 138 ods. 20 písm. b) druhom bode a písmene d) druhom bode, v § 138 ods. 21 písm. b), odseku 22 písm. z) druhom bode, odseku 23 písm. a) druhom bode a odseku 29 písm. n) sa do 25. mája 2021 vzťahujú na aktívnu implantovateľnú zdravotnícku pomôcku, zdravotnícku pomôcku a diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro.“
  • V zmysle ustanovenia § 143k ods. 6 a 7 Zákona o liekoch: „(6) Pri rozhodovaní, či výrobok je humánnym liekom, zdravotníckou pomôckou, diagnostickou zdravotníckou pomôckou in vitro alebo aktívnou implantovateľnou zdravotníckou pomôckou, sa zohľadňuje jeho hlavný účinok pôsobenia. (7) Pri rozhodovaní, či výrobok je humánnym liekom, zdravotníckou pomôckou, diagnostickou zdravotníckou pomôckou in vitro, aktívnou implantovateľnou zdravotníckou pomôckou, sa zohľadňuje v prípade lieku hlavný účinok, v prípade zdravotníckych pomôcok hlavný mechanizmus účinku, ktorým sa dosiahne účel určenia stanovený výrobcom.“
  • V zmysle ustanovenia § 143m ods. 1 písm. a) Zákona o liekoch: „Výrobca zdravotníckej pomôcky vrátane diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro je fyzická osoba alebo právnická osoba, ktorá zodpovedá za konštrukčné riešenie, výrobu, systém kvality výroby, balenie, označovanie a účel určenia zdravotníckej pomôcky alebo za montovanie, spracovanie, obnovenie, balenie, označovanie a účel určenia prefabrikovaného výrobku. Povinnosti vyplývajúce z tohto zákona a z osobitných predpisov, ktoré sa vzťahujú na výrobcu zdravotníckej pomôcky, sa vzťahujú aj na fyzickú osobu alebo právnickú osobu, ktorá montuje, balí, spracúva, obnovuje alebo označuje nálepkou jeden alebo viac prefabrikovaných výrobkov alebo im určuje účel určenia ako zdravotníckej pomôcke a uvádza ich na trh; plnenie týchto povinností sa nevzťahuje na fyzickú osobu alebo právnickú osobu, ktorá montuje alebo prispôsobuje pacientom zdravotnícke pomôcky už uvedené na trh v súlade s ich účelom určenia.“
  • V zmysle ustanovenia § 143m ods. 2 a 3 Zákona o liekoch: „(2) Výrobca s miestom podnikania alebo so sídlom v Slovenskej republike, ktorý uvádza zdravotnícku pomôcku na trh alebo uvádza do prevádzky podľa osobitných predpisov, a fyzická osoba s miestom podnikania alebo právnická osoba so sídlom v Slovenskej republike, ktorá kompletizuje alebo sterilizuje zdravotnícku pomôcku s cieľom uviesť ju na trh alebo do prevádzky podľa osobitných predpisov, písomne oznámi štátnemu ústavu adresu miesta podnikania alebo adresu sídla a opis zdravotníckej pomôcky uvádzanej na trh alebo do prevádzky (ďalej len „registrácia výrobcu zdravotníckej pomôcky“). (3) Ak výrobca, ktorý uvádza zdravotnícku pomôcku na trh alebo do prevádzky podľa osobitných predpisov, nemá miesto podnikania alebo sídlo v niektorom členskom štáte, určí splnomocnenca. Na splnomocnenca, ktorý má bydlisko alebo miesto podnikania, alebo sídlo v Slovenskej republike, sa vzťahuje registrácia výrobcu zdravotníckej pomôcky podľa odseku 2. Štátny ústav na požiadanie informuje príslušné orgány iných členských štátov a Komisiu o údajoch, ktoré predložil výrobca alebo splnomocnenec pri registrácii výrobcu zdravotníckej pomôcky.“
  • V zmysle ustanovenia § 143m ods. 4 Zákona o liekoch: „(4) Výrobca zdravotníckej pomôcky triedy IIa, IIb a III s miestom podnikania alebo so sídlom mimo územia Slovenskej republiky alebo jeho splnomocnenec písomne oznámi štátnemu ústavu údaje umožňujúce identifikáciu tohto výrobcu a identifikáciu zdravotníckej pomôcky uvádzanej na trh v Slovenskej republike spolu s označením a návodom na použitie. Výrobca aktívnej implantovateľnej zdravotníckej pomôcky, diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro a zdravotníckej pomôcky triedy I s miestom podnikania alebo so sídlom mimo územia Slovenskej republiky alebo jeho splnomocnenec môže písomne oznámiť štátnemu ústavu údaje umožňujúce identifikáciu tohto výrobcu a identifikáciu zdravotníckej pomôcky uvádzanej na trh v Slovenskej republike spolu s označením a návodom na použitie.“
  • V zmysle ustanovenia § 143m ods. 5 Zákona o liekoch: „(5) Štátny ústav po registrácii výrobcu zdravotníckej pomôcky podľa odsekov 2 a 3 alebo po prijatí oznámenia výrobcu podľa odseku 4 pridelí zdravotníckej pomôcke, aktívnej implantovateľnej zdravotníckej pomôcke a diagnostickej zdravotníckej pomôcke in vitro kód. Štátny ústav priebežne vedie, kontroluje a aktualizuje databázu zdravotníckych pomôcok; ak zdravotnícka pomôcka, aktívna implantovateľná zdravotnícka pomôcka alebo diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro už nespĺňa požiadavky na uvedenie na trh alebo na uvedenie do prevádzky, štátny ústav tejto zdravotníckej pomôcke, aktívnej implantovateľnej zdravotníckej pomôcke alebo diagnostickej zdravotníckej pomôcke in vitro zruší registráciu formou rozhodnutia alebo vypustí zdravotnícku pomôcku, aktívnu implantovateľnú zdravotnícku pomôcku alebo diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro z databázy zdravotníckych pomôcok a písomne o tom informuje výrobcu alebo splnomocnenca. Po nadobudnutí právoplatnosti rozhodnutia o zrušení registrácie alebo vypustení zdravotníckej pomôcky, aktívnej implantovateľnej zdravotníckej pomôcky alebo diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro z databázy zdravotníckych pomôcok štátny ústav zruší pridelený kód. Štátny ústav poskytuje v elektronickej podobe údaje z databázy zdravotníckych pomôcok národnému centru.“
  • V zmysle ustanovenia § 143m ods. 6 a 7 písm. a) Zákona o liekoch: „(6) Ak je diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro, ktorá má značku zhody pri zaregistrovaní podľa odseku 2, novým výrobkom, výrobca to uvedie v oznámení štátnemu ústavu. Na základe tohto oznámenia výrobca v priebehu nasledujúcich dvoch rokov predkladá štátnemu ústavu každé dva mesiace správu o získaných skúsenostiach vzťahujúcich sa na diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro po jej uvedení na trh. (7) Diagnostická zdravotnícka pomôcka in vitro sa považuje za novú, ak je určená na a) analyzovanie novej látky alebo hodnotenie novej veličiny a nebola zabezpečená sústavná dostupnosť diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro na trhu Slovenskej republiky počas predchádzajúcich troch rokov (…).“
  • V zmysle ustanovenia § 3 ods. 2 zákona č. 56/2018 Z. z. o posudzovaní zhody výrobku, sprístupňovaní určeného výrobku na trhu a o zmene a doplnení niektorých zákonov, v platnom znení (ďalej len „Zákon o posudzovaní zhody“): „Úrad je notifikujúcim orgánom podľa tohto zákona a podľa osobitných predpisov a orgánom zodpovedným za notifikované osoby podľa osobitného predpisu.[2]
  • V zmysle ustanovenia § 14 ods. 5 Zákona o posudzovaní zhody: „Rozhodnutie o autorizácii je platné päť rokov od nadobudnutia právoplatnosti rozhodnutia o autorizácii, ak v rozhodnutí o autorizácii nie je uvedený kratší čas platnosti, ak osobitný predpis2 neustanovuje inak.“
  • V zmysle ustanovenia § 31 ods. 5 Zákona o posudzovaní zhody: „Nariadenie vlády Slovenskej republiky č. 569/2001 Z. z., ktorým sa ustanovujú podrobnosti o technických požiadavkách a postupoch posudzovania zhody diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro v znení neskorších predpisov vydané na základe zákona č. 264/1999 Z. z. o technických požiadavkách na výrobky a o posudzovaní zhody a o zmene a doplnení niektorých zákonov v znení neskorších predpisov zostávajú platné a účinné do 25. mája 2022.“
  • V zmysle ustanovenia § 2 ods. 1 Nariadenia vlády Slovenskej republiky č. 569/2001 Z. z., ktorým sa ustanovujú podrobnosti o technických požiadavkách a postupoch posudzovania zhody diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro, v platnom znení (ďalej len „Nariadenie vlády“): „Pomôcky vrátane pomôcok na hodnotenie funkčnosti sa môžu uviesť na trh podľa § 10 zákona len vtedy, keď spĺňajú technické požiadavky na bezpečnosť podľa nariadenia a keď po ich správnom zavedení, inštalovaní, udržiavaní a používaní v súlade s ich účelom určenia nedôjde k ohrozeniu bezpečnosti a zdravia pacientov, používateľov, prípadne iných osôb.“
  • V zmysle ustanovenia § 4 ods. 2 Nariadenia vlády: „Pri pomôckach okrem pomôcok uvedených v prílohe č. 2 a pomôcok určených na hodnotenie funkčnosti výrobca pri označovaní značkou zhody použije postup uvedený v prílohe č. 3 a pred uvedením pomôcky na trh vydá ES vyhlásenie o zhode.“
  • Z citovaných ustanovení vyplýva, že výrobca je povinný predkladať Štátnemu ústavu na kontrolu liečiv každé dva mesiace správu o získaných skúsenostiach vzťahujúcich sa na diagnostickú zdravotnícku pomôcku in vitro po jej uvedení na trh, a Štátny ústav na kontrolu liečiv má oprávnenie zrušiť registráciu diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro, a v zmysle ustanovenia § 114 ods. 1 Zákona o liekoch môže v záujme zabezpečenia ochrany zdravia a bezpečnosti pacienta pri používaní diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro zakázať uvedenie na trh alebo uvedenie do používania diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro alebo skupiny diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro, ako aj nariadiť stiahnutie diagnostickej zdravotníckej pomôcky in vitro alebo skupiny diagnostických zdravotníckych pomôcok in vitro z trhu alebo z používania.
  • Uvedené však nič nemení na skutočnosti, že platná legislatíva nestanovuje povinnosť pred uvedením testov ako zdravotníckej pomôcky do praxe vykonať kompetentnými orgánmi Slovenskej republiky vlastné klinické hodnotenie testov používaných na celoplošné testovanie obyvateľstva, ako zdravotníckych prostriedkov, ani hodnotenie ich funkčnej spôsobilosti, ako diagnostických zdravotníckych prostriedkov in vitro. V rovine európskej legislatívy ide vo vzťahu ku klinickému hodnoteniu zdravotníckych prostriedkov, a vo vzťahu k hodnoteniu funkčnej spôsobilosti diagnostických zdravotníckych prostriedkov in vitro pred ich uvedením na trh, iba o odporúčania.
  • Aktuálna legislatíva teda umožňuje uviesť na slovenský trh aj testy, ktoré môžu byť ľuďom zdraviu nebezpečné, minimálne v tej rovine, že nesprávnou detekciou COVID-19 umožňujú ďalšie šírenie vírusu. Na tomto mieste je vhodné podotknúť, že eventuálne následky v podobe poškodenia zdravia, ktoré mohli nastať chybnou diagnózou za použitia testov, uvedenie ktorých na trh je zdraviu nebezpečné, si zaslúži osobitné preskúmanie.

Základ fungovania RT-PCR testov a antigénových testov

  • O koronavírusoch sa predpokladá, že ide o obalené RNA vírusy, ktoré sú medzi ľuďmi, inými cicavcami a vtákmi značne rozšírené, spôsobujú respiračné, enterické, hepatálne a neurologické ochorenia. Predpokladá sa, že existuje sedem druhov koronavírusov, o ktorých je známe, že spôsobujú ochorenia u ľudí. štyri vírusy – 229E, OC43, NL63 a HKU1 – sú prevalentné a zvyčajne vyvolávajú bežné symptómy prechladnutia u jedincov s oslabenou imunitou. Ďalšie údajné tri kmene – koronavírus závažného akútneho respiračného syndrómu (SARS-CoV), koronavírus stredovýchodného respiračného syndrómu (MERS-CoV) a nový koronavírus 2019 (COVID-19) – majú zoonotický pôvod a spájajú sa s ochoreniami, ktoré majú niekedy smrteľné následky.
  • Žiaden z genómov koronavírusu doposiaľ nebol štandardnou vedeckou cestou izolovaný a preukázaný, a to nielen ako infekčný, ale ani ako existujúci. Ak sa porovnávajú rôzne laboratórne artefakty (umelo vytvorené genómy vírusu), tieto síce môžu vykazovať podobnosť s genómami skutočných mikróbov, ktoré by sa získali ich izoláciou, avšak stále zostanú iba artefaktmi, ktoré nemajú so životom mimo laboratória nič spoločné. Vedecké zákonitosti a pravidlá, ktoré sú aplikované na biológiu, chémiu a fyziku žiaľ neplatia pri ich aplikácii v medicíne. Izolácia vírusu má celkom iný význam v nemedicínskej biológii a úplne inak sa vykladá na úrovni medicínskej virológie.
  • Vo vzťahu k posledným koronavírusom sa v medicíne už ani len nepredstiera snaha o zdanlivú izoláciu aspoň vírusových bielkovín, pričom tento krok laboratóriá pravdepodobne nahrádzajú syntetickým generovaním proteínov z umelo vytvorených génov umelo vytvoreného vírusového genómu. Z vedeckého hľadiska preto celá medicínska virológia stojí takpovediac „na hlinených nohách“. Uvedené potvrdzuje aj Uznesenie Najvyššieho súdu Spolkovej republiky Nemecko v právnej veci Lanka vs. Bardens zo dňa 16.2.2016, ktorým súd vyslovil, že postup „kultivácie“ (dôkaz existencie vírusu na základe cytopatického efektu, t. j. umierania buniek) nemôže byť považovaný za dôkaz o existencii vírusu. Preto kým nebude vykonaná skutočná izolácia genómov koronavírusu z preukázateľne izolovaných vírusových častíc, a kým nebude jeho dĺžka zmeraná a doložená gélovou elektroforézou, nie je vedecky možné identifikovať genómy koronavírusu ako také, a teda ani vytvoriť test na detekciu prítomnosti koronavírusu v živom organizme. Kultivácia ako taká je síce bežným laboratórnym postupom, avšak v prípade medicínskej virológie sa tento proces stal postupom k dosiahnutiu tzv. cytopatického efektu, t. j. umierania buniek, pri ktorom vznikajú malé častice, o ktorých sa tvrdí, že sú dôkazom množenia vírusu. V skutočnosti je to však iba následok pôsobenia antibiotík, nedostatočnej výživy bunkových kultúr, a ich vystavenie laboratórnym podmienkam.
  • Základom pre fungovanie RT-PCR testov a antigénových testov je tzv. „pufer“. Antigénové testy majú v pufri pre internú kontrolu antigén, ktorý nesmie byť zhodný s údajným SARS-CoV-2 antigénom. Keď sa zmiešaná vzorka s pufrom pri antigénovom teste následne nakvapká na test, tekutina vzlína k čiarkám. V prvej čiarke sú protilátky proti údajnému antigénu SARS-CoV-2 a v druhej čiarke sú protilátky proti antigénom v pufri. Pre potvrdenie, že test funguje, sa musia zafarbiť obe čiarky. Problémom antigénového testu však je, že protilátky v skutočnosti nie sú vôbec špecifické (iba sa vychádza z predpokladu, ako keby boli). Práve vzhľadom na absenciu preukázateľne izolovaných vírusových častíc v pufri nedokážu antigénové testy detegovať COVID-19, ale namiesto neho detegujú rôzne látky, ktoré v konečnom dôsledku nemusia mať s koronavírusom vôbec nič spoločné.
  • PCR testy majú v pufri RNA pre internú kontrolu, či vôbec došlo k prepisu, a následne k zosilneniu (tieto pridané RNA do pufru údajne nie sú zhodné s hľadanou RNA). Problém PCR testu je, že PCR je výrobná metóda, ktorá vyrába molekuly RNA / DNA. Vyrába teda čokoľvek, čo je vo vzorke vnesené ako matrica. Preto je pri tejto metóde dôležité vopred vedieť, aký genetický materiál sa vo vzorke nachádza, a nepoužívať na detekciu umelo vytvorený genetický materiál. Problém nastáva už v RT fáze (reverznej transkripcii, resp. reverzného prepisu). Pri prepise RNA na DNA dochádza k chybám, čo znamená, že už táto prvá fáza môže spôsobiť chybné výsledky. Následne sa vo všeobecnosti spolieha na to, že sa primery a sondy naviažu správne tam, kam sa nadviazať majú. To však v skutočnosti nie je preukázané a uvedeného sa môžeme iba domnievať, resp. v to dúfať. Uvoľnená fluorescencia zo sondy (potvrdenie pozitivity) môže byť navyše spôsobená aj nepredpokladanými enzýmami vo vzorke, ktoré zapôsobia na sondu. Na predmetnú metódu sa teda z vedeckého hľadiska nie je vôbec možné spoľahnúť ako na diagnostickú metódu, a to ani keby bol vírus správne izolovaný a opísaný,
    t. j. ani keby boli dodržané tzv. Kochove postuláty.
  • Polymerázová reťazová reakcia (PCR) totiž primárne slúži ako technika k namnoženiu (zosilneniu) miliónov exaktných kópií určitej časti reťazca DNA, prípadne RNA (RNA musí byť najprv prevedená na cDNA pomocou reverznej transkriptázy, preto sa označuje ako RT-PCR). Základom testov RT-PCR, nesprávne používaných na detekciu údajného vírusu SARS-CoV-2, je predpoklad, že detekcia niekoľkých úsekov RNA (väčšina testov hľadá 2-3 gény, ale mnoho výrobcov v príbalovom letáku uvádza, že stačí detekcia iba jedného génu SARS-CoV-2, aby bol test RT-PCR vyhodnotený ako pozitívny) s dĺžkou rádovo stoviek nukleotidov, preukazuje prítomnosť celého genómu SARS-CoV-2, u ktorého sa udáva dĺžka okolo 30.000 nukleotidov. To znamená, že detekcia menej ako 1% genómu SARS-CoV-2 sa považuje za dôkaz celého, neporušeného, ​​infekcieschopného SARS-CoV-2. Pre PCR je nutná znalosť presnej sekvencie nukleotidov skúmaného úseku DNA / RNA, čo v prípade SARS-CoV-2 nie je možné, pretože do dnešného dňa nebol, a ani nikdy nemôže byť, izolovaný a purifikovaný. Pozitívny výsledok testu PCR preto neznamená, že je v skúmanej vzorke prítomný SARS-CoV-2. K rovnakému záveru dospel aj Vysoký administratívny súd pre oblasť Severného Porýnia-Západ, ktorý svojím rozhodnutím v správnom súdnom konaní so sp. zn. 13 B 1780/20.NE zo dňa 25.11.2020 vyslovil, že „test PCR ako taký nedokazuje v jednotlivých prípadoch infekčnosť.“
  • Rovnako tak nie je možné vytvoriť ani testy antigénové a protilátkové. Antigénové testy na COVID-19 údajne detegujú antigény špecifické pre SARS-CoV-2. Pre vytvorenie takýchto testov je nevyhnutné mať k dispozícii protilátky, ktoré sú špecifické len pre SARS-CoV-2. To bez izolácie vírusu nie je možné, pričom v súčasnosti sa namiesto izolácie používa metóda „kultivácie“. Kultivácia v mikrobiológii vo všeobecnosti znamená cielené udržiavanie životných (kultivačných) podmienok určitého organizmu, ktorý bol odobraný z jeho prirodzeného prostredia. Vírusy sa kultivujú najčastejšie na bunkových kultúrach, menej často v kuracích embryách alebo pokusných zvieratách. Vznik cytopatického efektu (morfologicky zjavných zmien) v bunkovej kultúre sa považuje za dôkaz, že v skúmanej vzorke je prítomný vírus, ktorý tieto zmeny spôsobil. Rovnaké zmeny na bunkových kultúrach však môže spôsobiť aj vzorka, ktorá vírusy vôbec neobsahuje. Preto by sa mali vykonávať kontrolné experimenty.

Výkonnosť a špecificita RT-PCR testov

  • Eurosurveillance (Eurodohľad) je európsky recenzovaný vedecký časopis zameraný na epidemiológiu, dohľad, prevenciu a kontrolu prenosných chorôb so zameraním na také témy, ktoré majú pre Európu význam. Jedná sa o týždenný online časopis s 50 číslami ročne, ktorý vychádza každý štvrtok a obsahuje krátke informácie o rýchlej komunikácii, dlhšie dôkladné výskumné články, správy o dohľade a vypuknutí choroby, recenzie a perspektívne články, ako aj krátke správy. Včasné uverejnenie krátkych smerodajných správ o prebiehajúcich ohniskách alebo iných významných udalostiach v oblasti verejného zdravia je jednou z hlavných výhod časopisu. Za zvláštnych okolností, keď je potrebné urgentne oznámiť čitateľom aktuálne udalosti, aby sa dosiahli rýchle kroky v oblasti verejného zdravia, je možné elektronické výstrahy vydávať mimo bežného harmonogramu publikovania. Lokálne kompilácie vybraných článkov a špeciálne čísla vychádzajú aj v tlačenej podobe s obmedzeným počtom výtlačkov.
  • Od roku 1995 poskytuje Eurosurveillance európskemu spoločenstvu verejného zdravia platformu otvoreného prístupu na výmenu relevantných poznatkov o dohľade, prevencii a kontrole prenosných chorôb. Cieľom Eurosurveillance je týždenná elektronická recenzovaná publikácia, ktorej cieľom je poskytnúť včasné fakty a pokyny odborníkom v oblasti verejného zdravotníctva a osobám s rozhodovacími právomocami v oblasti infekčných chorôb, aby sa uľahčilo vykonávanie účinných preventívnych a kontrolných opatrení. Pán Victor M Corman, pán Christian Drosten, a kolektív, uverejnili na webe elektronického časopisu Eurosurveillance dňa 23.1.2020 článok s názvom „Detekcia nového koronavírusu z roku 2019 (2019-nCoV) pomocou RT-PCR v reálnom čase.“
  • Dňa 23. januára 2020 časopis Eurosurveillance uverejnil článok od Corman-Drosten a kol. Dňa 27. novembra 2020 časopis Eurosurveillance uverejnil článok s názvom „Správa o preskúmaní článku od Corman-Drosten a kol. Eurosurveillance 2020“. Táto rozsiahla správa o preskúmaní bola redakčnej rade Eurosurveillance oficiálne predložená 27. novembra 2020 prostredníctvom ich portálu na predkladanie správ. K tejto správe o preskúmaní je pripojený list so žiadosťou o stiahnutie článku od Corman-Drosten a kol., podpísaný všetkými hlavnými autormi a spoluautormi správy a žiadosti. Cieľom správy o preskúmaní je vyvrátiť tvrdenia a závery uvádzané v článku od Corman-Drosten a kol. V zmysle tejto správy: „Externé partnerské preskúmanie testu RTPCR na detekciu SARS-CoV-2 odhaľuje 10 hlavných vedeckých nedostatkov na molekulárnej a metodickej úrovni, ktorých dôsledkom sú falošne pozitívne výsledky.“ Správa uvádza nasledovné:

„V publikácii s názvom „Detekcia nového koronavírusu 2019 (2019-nCoV) pomocou RT-PCR v reálnom čase“ (Eurosurveillance 25 (8) 2020) autori uvádzajú diagnostický pracovný tok a protokol RT-qPCR na detekciu a diagnostiku 2019-nCoV. (teraz známe ako SARS-CoV-2), o ktorých tvrdia, že sú validované, ako aj o robustnej diagnostickej metodike na použitie v laboratóriách verejného zdravotníctva. Vo svetle všetkých dôsledkov, ktoré z tejto publikácie vyplynú pre spoločnosti na celom svete, skupina nezávislých výskumníkov vykonala bodové preskúmanie vyššie uvedenej publikácie, v ktorej 1) boli podrobené krížovej kontrole všetky súčasti predloženého návrhu testu, 2) Odporúčania protokolu RT-qPCR boli hodnotené w.r.t. vhodnou laboratórnou praxou a 3) parametre boli preskúmané oproti príslušnej vedeckej literatúre týkajúcej sa tejto oblasti.

Publikovaný protokol RT-qPCR na detekciu a diagnostiku 2019-nCoV a rukopis trpia mnohými technickými a vedeckými chybami, medzi ktoré patrí nedostatočný dizajn primerov, problematický a nedostatočný protokol RT-qPCR a absencia presnej validácie testu. Predložený test, ani samotný rukopis, nespĺňajú požiadavky na prijateľnú vedeckú publikáciu. Ďalej, v článku nie sú uvedené závažné konflikty záujmov autorov. Napokon, veľmi krátky časový harmonogram medzi odovzdaním a prijatím publikácie (24 hodín) znamená nezvládnutie problematiky v článku, alebo že sa tu nevykonával systematický proces vzájomného hodnotenia. Poskytujeme presvedčivé dôkazy o niekoľkých vedeckých nedostatkoch, chybách a trhlinách. Vzhľadom na tu uvedené vedecké a metodologické nedostatky sme presvedčení, že redakčnej rade Eurosurveillance nezostáva iné, ako publikáciu stiahnuť.

Stručná revízna správa: Tento príspevok ukáže početné závažné nedostatky v dokumente Corman-Drosten, ktorého význam viedol k celosvetovej nesprávnej diagnóze infekcií pripisovaných SARS-CoV-2 a súvisiacich s ochorením COVID-19. Sme konfrontovaní s prísnymi karanténami, ktoré zničili životy a živobytie mnohých ľudí, obmedzeným prístupom k vzdelaniu, a tieto uložené obmedzenia vládami po celom svete sú priamym útokom na základné práva ľudí a ich osobné slobody, čo má za následok vedľajšie škody pre celé ekonomiky na globálnej škále. Článok od Corman-Drosten obsahuje desať fatálnych problémov, ktoré si v nasledujúcich častiach načrtneme a podrobnejšie vysvetlíme.

Prvým a hlavným problémom je, že nový koronavírus SARS-CoV-2 (v publikácii s názvom 2019-nCoV a vo februári 2020 s názvom SARS-CoV-2 od medzinárodného konzorcia odborníkov na vírusy) je založený na in silico (teoretických) sekvenciách , dodané laboratóriom v Číne, pretože v tom čase autori nemali k dispozícii ani kontrolný materiál infekčného („živého“) alebo inaktivovaného vírusu SARS-CoV-2, ani izolovanú genómovú RNA vírusu. K dnešnému dňu nebola vykonaná žiadna validácia autenticity na základe izolovaných vírusov SARS-CoV-2 alebo ich úplnej RNA. Podľa Cormana a kol .: „Naším cieľom bolo vyvinúť a nasadiť robustnú diagnostickú metodológiu pre použitie v laboratóriách verejného zdravotníctva bez toho, aby bol k dispozícii vírusový materiál.“

Tu by sa mala zamerať pozornosť na dva stanovené ciele: a) vývoj, a b) nasadenie diagnostického testu na použitie v laboratórnych podmienkach verejného zdravotníctva. Tieto ciele nie je možné dosiahnuť bez toho, aby bol k dispozícii akýkoľvek aktuálny vírusový materiál (napr. na stanovenie infekčnej vírusovej záťaže). V každom prípade, iba protokol s maximálnou presnosťou môže byť povinným a primárnym cieľom v každom scenári-výsledku tohto rozsahu. Stanovenie kritickej vírusovej záťaže je povinnou informáciou a uskutočnenie týchto experimentov a poskytnutie rozhodujúcich údajov je zodpovednosťou skupiny pána Christian Drosten. Napriek tomu sa tieto sekvencie in silico („in silico“ je výraz vo význame „uskutočňovaný na počítači alebo pomocou počítačovej simulácie“ vo vzťahu k biologickým experimentom) použili na vývoj metodiky testovania RT-PCR na identifikáciu vyššie uvedeného vírusu. Tento model bol založený na predpoklade, že nový vírus je veľmi podobný SARS-CoV z roku 2003, pretože oba sú beta-koronavírusy.

Test PCR bol preto navrhnutý s použitím genómovej sekvencie SARS-CoV ako kontrolného materiálu pre zložku Sarbeco; vieme to z našej osobnej e-mailovej komunikácie s jedným zo spoluautorov článku Corman-Drosten. Táto metóda na modelovanie SARS-CoV-2 bola v dokumente Corman-Drosten popísaná nasledovne: „Zavedenie a validácia diagnostického pracovného toku pre skríning 2019-nCoV a špecifické potvrdenie určené pre absenciu dostupných vírusových izolátov alebo originálnych vzoriek pacientov. Dizajn a validáciu umožnila úzka genetická príbuznosť so SARS-CoV z roku 2003 a pomohla k nej aj technológia syntetických nukleových kyselín.“ Reverzná transkripčno-polymerázová reťazová reakcia (RT-PCR) je dôležitá biomolekulárna technológia na rýchlu detekciu vzácnych fragmentov RNA, ktoré sú vopred známe. V prvom kroku sú molekuly RNA prítomné vo vzorke reverzne transkribované, čím sa získa cDNA. cDNA sa potom zosilnie v polymerázovej reťazovej reakcii pomocou špecifického páru primerov a termostabilného enzýmu DNA polymerázy. Táto technológia je vysoko citlivá a jej detekčný limit je teoreticky 1 molekula cDNA. Špecificita PCR je vysoko ovplyvnená chybami biomolekulárneho dizajnu.

Čo je dôležité pri navrhovaní testu RT-PCR a kvantitatívneho testu RT-qPCR opísaného v publikácii Corman-Drosten?

1.  Primery a sondy:

a)  koncentrácia primerov a sond musí byť v optimálnom rozmedzí (100 – 200 nM);

b)  musí byť špecifický pre cieľový gén, ktorý chceme zosilňovať;

c)  musí mať optimálne percento obsahu GC v pomere k celkovému obsahu dusíkatých zásad (minimálne 40%, maximálne 60%);

d)  na diagnostiku vírusov musia minimálne 3 páry primerov detegovať 3 vírusové gény (vo vírusovom genóme, pokiaľ možno čo najďalej od seba);

2.  Teplota, pri ktorej prebiehajú všetky reakcie:

a)  teplota topenia DNA (> 92°);

b)  teplota zosilňovania DNA (konkrétne TaqPol);

c)  Tm; teplota žíhania (teplota, pri ktorej primery a sondy dosiahnu cieľové naviazanie / oddelenie, nesmie prekročiť 2°C na pár primerov). Tm silne závisí od obsahu GC v primeroch;

3.  Počet zosilňovacích cyklov (menej ako 35; najlepšie 25-30 cyklov). V prípade detekcie vírusu, menej ako 35 cyklov deteguje  iba signály, ktoré nekorelujú s infekčným vírusom, ako je určené izoláciou v bunkovej kultúre. Ak je niekto testovaný pomocou PCR ako pozitívny, a použije sa prahová hodnota 35 cyklov alebo vyššia (ako je to vo väčšine laboratórií v Európe a USA), je pravdepodobnosť, že uvedená osoba je skutočne infikovaná, menšia ako 3%, pravdepodobnosť, že uvedený výsledok je falošne pozitívny, je 97%;

4.  Molekulárne biologické validácie. Zosilnené produkty PCR musia byť validované buď tokom produktov v gély s DNA meradlom, alebo priamym sekvenovaním DNA;

5.  Mali by sa určiť pozitívne a negatívne kontroly na potvrdenie / vyvrátenie špecifickej detekcie vírusu;

6.  Mal by byť k dispozícii štandardný operačný postup (SOP). SOP jednoznačne špecifikuje vyššie uvedené parametre, takže všetky laboratóriá sú schopné nastaviť presne rovnaké testovacie podmienky. Mať overený univerzálny SOP je nevyhnutné, pretože umožňuje porovnanie údajov v rámci krajín, ako aj medzi nimi.

Menšie obavy ohľadom článku Corman-Drosten:

1. V prvej tabuľke dokumentu Corman-Drosten sú uvedené rôzne skratky – „nM“ je definovaná, „nm“ nie je. Ďalej, pokiaľ ide o správnu nomenklatúru, „nm“ znamená „nanometer“, preto by tu mal byť namiesto „nm“ údaj „nM“;

2. Všeobecne existuje zhoda v písaní genetických sekvencií vždy v smere 5’-3’, vrátane reverzných primerov. Je veľmi neobvyklé robiť porovnanie s reverzným komplementárnym zápisom sekvencie primerov, ako to urobili autori na Obrázku 2 (nižšie) v dokumente Corman-Drosten. Tu je navyše zvlnená základňa označená ako „y“ bez popisu základov, ktoré Y znamená;

3. Dve zavádzajúce úskalia v dokumente Corman-Drosten spočívajú v tom, že ich prvá tabuľka neobsahuje hodnoty Tm (hodnoty teploty žíhania), ani neukazuje hodnoty GC (počet G a C v sekvenciách ako % -hodnota celej bázy).

Hlavné obavy ohľadom článku Corman-Drosten:

  1. Súvislosti:

Autori predstavili pozadie svojej vedeckej práce nasledovne: „Prebiehajúce prepuknutie nedávno objaveného nového koronavírusu (2019-nCoV) predstavuje výzvu pre laboratóriá verejného zdravotníctva, pretože vírusové izoláty nie sú k dispozícii, pričom stále pribúdajú dôkazy o tom, že prepuknutie choroby je rozšírenejšie, ako sa v súčasnosti. pôvodne myslelo, a medzinárodné šírenie cez cestujúcich už nastáva.“ Podľa správ BBC News a štatistík Google došlo 21. januára 2020 – v deň predloženia článku Corman-Drosten – na celom svete k 6 úmrtiam. Prečo autori prijali výzvu pre laboratóriá verejného zdravotníctva, keď v tom čase neexistovali nijaké dôkazy, ktoré by naznačovali, že ohnisko bolo rozšírenejšie, ako sa pôvodne myslelo? Ako cieľ autori deklarovali vývoj a nasadenie robustnej diagnostickej metodológie pre použitie v laboratóriách verejného zdravotníctva bez dostupnosti vírusového materiálu. Ďalej uznávajú, že: „Táto štúdia demonštruje obrovskú schopnosť reakcie dosiahnutú koordináciou akademických a verejných laboratórií v národných a európskych výskumných sieťach.“

  • Metódy a výsledky:
  • Dizajn primeru a sondy:

1a)Chybné koncentrácie primerov:

Spoľahlivé a presné protokoly na testovanie PCR sa bežne navrhujú s použitím 100 nM až 200 nM na primer. V dokumente Corman-Drosten pozorujeme neobvykle vysoké a meniace sa koncentrácie primerov pre niekoľko primerov (Tabuľka 1). Pre páry primerov RdRp_SARSr-F a RdRp_SARSr-R je opísaných 600 nM a 800 nM. Podobne pre sadu primerov N_Sarbeco_F a N_Sarbeco_R odporúčajú 600 nM, respektíve 800 nM. Malo by byť zrejmé, že tieto koncentrácie sú príliš vysoké na to, aby boli optimálne pre špecifické zosilnenie cieľových génov. Neexistuje žiadny špecifikovaný dôvod na použitie týchto extrémne vysokých koncentrácií primerov v tomto protokole. Tieto koncentrácie vedú skôr k zvýšenej nešpecifickej väzbe a zosilneniu produktu PCR.

1b)Nešpecifikované („vratké“) sekvencie primerov a sond:

Na získanie reprodukovateľných a porovnateľných výsledkov je nevyhnutné osobitne definovať páry primerov. V dokumente Corman-Drosten sme pozorovali šesť nešpecifikovaných polôh, označených písmenami R, W, M a S. Písmeno W znamená, že v tejto polohe môže byť buď A alebo T; R znamená, že môže existovať buď G alebo A; M označuje, že poloha môže byť buď A alebo C; písmeno S označuje, že na tejto pozícii môže byť buď G alebo C. Tento vysoký počet variantov je nielen neobvyklý, ale aj veľmi mätúci pre laboratóriá. Týchto šesť nešpecifikovaných pozícií by mohlo ľahko vyústiť do návrhu niekoľkých rôznych alternatívnych sekvencií primerov, ktoré sa netýkajú SARS-CoV-2 (2 odlišné primery RdRp_SARSr_F + 8 odlišných sond RdRp_SARS_P1 + 4 odlišné RdRp_SARSr_R). Dizajnové variácie nevyhnutne povedú k výsledkom, ktoré sa ani netýkajú SARS CoV-2. Mätúci nešpecifický popis v dokumente Corman-Drosten preto nie je vhodný ako štandardný prevádzkový protokol. Tieto nešpecifikované polohy mali byť navrhnuté jednoznačne. Tieto vratké sekvencie už vytvorili v tejto oblasti zdroj obáv a vyústili do listu našej redakcie, ktorého autorom je Pillonel a kol., týkajúce sa do očí bijúcich chýb v opísaných sekvenciách. Tieto chyby sú zrejmé aj v prílohe dokumentu  v Corman-Drosten a kol.

Protokol WHO, ktorý priamo pochádza z dokumentu Corman-Drosten, dospel k záveru, že na potvrdenie prítomnosti SARS-CoV-2 musia byť identifikované dva kontrolné gény (gény E- a RdRp) v teste. Je potrebné poznamenať, že gén RdPd má jednu neistú pozíciu („kolísavú“) na priamom primeri (R = G / A), dve neisté polohy v reverznom primeri (R = G / A; S = G / C) a má tri neisté polohy v sonde RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Pre RdPd-gén teda možno syntetizovať dva rôzne priame primery, štyri rôzne reverzné primery a osem odlišných sond. Spolu existuje 64 možných kombinácií primerov a sond! Dokument Corman-Drosten ďalej identifikuje tretí gén, ktorý podľa protokolu WHO nebol ďalej validovaný a je považovaný za nepotrebný: „Je pozoruhodné, že test na gén N tiež fungoval dobre, ale nebol podrobený ďalšej intenzívnej validácii, pretože bol o niečo menej citlivý.“

Toto bolo poľutovaniahodné opomenutie, pretože najlepšie by bolo použiť všetky tri génové PCR ako potvrdzovacie testy, čo by viedlo k takmer dostatočnému protokolu diagnostických nástrojov na detekciu vírusovej RNA. Tri potvrdzujúce kroky testu by minimálne minimalizovali chyby a neistoty v každom kroku, pokiaľ ide o „vratké“ body. Napriek tomu by protokol pri zohľadnení všetkých ostatných chýb návrhu stále nespĺňal „dobrú laboratórnu prax“. V súčasnej podobe nie je analýza N génu navrhovaná v odporúčaní WHO, ako povinný a zásadný tretí potvrdzujúci krok, ani nie je zdôraznená v dokumente Corman-Drosten, ako dôležité voliteľné ubezpečenie „pre rutinný pracovný tok“. Preto sa takmer vo všetkých testovacích postupoch na celom svete použili namiesto všetkých troch iba 2 zhody primerov. Tento dohľad robí celý testovací protokol zbytočným, pokiaľ ide o poskytovanie presných výsledkov testov, ktoré majú skutočný význam v prebiehajúcej pandémii.

1c)Chybný obsah GC (diskutovaný v bode 2c, spolu s teplotou žíhania (Tm));

1d)Detekcia vírusových génov:

RT-PCR sa neodporúča na primárnu diagnostiku infekcie. To je dôvod, prečo RT-PCR test používaný v klinickej praxi na detekciu COVID-19 nie je indikovaný na diagnostiku COVID-19 na regulačnom základe. „Lekári musia rozpoznať zvýšenú presnosť a rýchlosť metód molekulárnej diagnostiky na diagnostiku infekcií, ale tiež pochopiť ich obmedzenia. Laboratórne výsledky by sa mali vždy interpretovať v kontexte klinického obrazu pacienta a pre spoľahlivé výsledky testu sa vyžaduje vhodné miesto, kvalita a načasovanie odberu vzoriek.“ Môže sa však použiť na pomoc pri diferenciálnej diagnostike lekára, keď musí rozlišovať medzi rôznymi infekciami pľúc (chrípka, Covid-19 a SARS majú veľmi podobné príznaky). Na potvrdzujúcu diagnózu špecifického vírusu sa musia použiť najmenej 3 páry špecifických primerov na detekciu 3 génov špecifických pre vírus. Najlepšie, ak by tieto cieľové gény boli umiestnené s čo najväčšou vzdialenosťou vo vírusovom genóme (vrátane opačných koncov).

Aj keď dokument Corman-Drosten popisuje 3 primery, tieto primery pokrývajú iba zhruba polovicu genómu vírusu. Toto je ďalší faktor, ktorý znižuje špecificitu pre detekciu intaktnej RNA vírusu COVID-19 a zvyšuje ponuku falošne pozitívnych výsledkov testu. Preto aj keď vo vzorke získame tri pozitívne signály (t. j. tri páry primerov poskytujúce 3 rôzne zosilňujúce produkty), nedokazuje to prítomnosť vírusu. Lepší dizajn primerov by mal terminálne primery na oboch koncoch vírusového genómu. Je tomu tak preto, lebo by bol pokrytý celý vírusový genóm a tri pozitívne signály môžu lepšie rozlišovať medzi úplným (a teda potenciálne infekčným) vírusom a fragmentovanými vírusovými genómami (bez infekčnej potencie). Aby sa dalo odvodiť všetko dôležité o infekčnosti vírusu, mal by sa ako cieľ zahrnúť gén Orf1, ktorý kóduje esenciálny replikázový enzým vírusov SARS-CoV. Umiestnenie cieľov v oblasti vírusového genómu, ktorá je najviac a variabilne transkribovaná, je ďalšou slabinou protokolu od Corman-Drosten.

Kim a kol. demonštrujú vysoko variabilné 3‘ vyjadrenie subgenomickej RNA v Sars-CoV-2. Tieto RNA sú aktívne monitorované, ako podpisy pre asymptomatických a neinfekčných pacientov. Je vysoko otázne skrínovať populáciu asymptomatických ľudí pomocou qPCR primerov, ktoré majú 6 bázových párov primer-dimérov na 3 hlavnom konci primeru. WHO podľa všetkého tieto primery odporúča. Testovali sme všetky vratké deriváty z dokumentu Corman-Drosten pomocou webového nástroja na meranie primerov „Thermofisher“ (zachytávač tepla). RdRp priamy primer má 6bp 3 hlavnú homológiu s reverzným Sarbeco E. Pri vysokých koncentráciách primerov to stačí na vytvorenie nepresností.

Poznámka: Existuje jeden z N primerov s klinickým patogénom (Pantoea), ktorý sa nachádza u pacientov so zníženou imunitou. Reverzný primer zasiahne aj patogén Pantoea, ale nie v rovnakej oblasti. Ide o závažné chyby návrhu, pretože test nedokáže rozlíšiť medzi celým vírusom a vírusovými fragmentmi. Test nemožno použiť ako diagnostiku na vírusy SARS.

2.  Reakčné teploty

2a)Teplota topenia DNA (> 92 °). Adekvátne uvedené v dokumente Corman-Drosten.

2b)Teplota zosilňovania DNA. Adekvátne uvedené v dokumente Corman-Drosten.

2c) Chybný obsah GC a Tm:

Teplota žíhania určuje, pri ktorej teplote sa primer pripája / odpája od cieľovej sekvencie. Pre efektívne a špecifické zosilňovanie by mal obsah GC v primeroch spĺňať minimálne 40% a maximálne 60% zosilňovania. Tri primery opísané v dokumente Corman-Drosten nie sú v normálnom rozmedzí pre obsah GC. Dva primery (RdRp_SARSr_F a RdRp_SARSr_R) majú neobvyklé a veľmi nízke hodnoty GC 28% – 31% pre všetky možné varianty kmitavých báz, zatiaľ čo primer E_Sarbeco_F má hodnotu GC 34,6%. Je potrebné poznamenať, že obsah GC vo veľkej miere určuje väzbu na jeho špecifický cieľ vďaka jeho trom vodíkovým väzbám v párovaní báz. Čím nižší je obsah GC v primeri, tým nižšia je jeho väzbová schopnosť k jeho špecifickej cieľovej génovej sekvencii (t. j. génu, ktorý sa má detegovať). To znamená, že je potrebné rozpoznať cieľovú sekvenciu a zvoliť teplotu, ktorá sa čo najviac blíži skutočnej žíhacej teplote (hodnota osvedčeného postupu), aby sa primer znova neoddelil, a zároveň špecificky zvoliť cieľovú sekvenciu.

Ak je hodnota Tm veľmi nízka, ako je pozorované u všetkých vratkých variantov reverzných primerov RdRp, môžu sa primery nešpecificky viazať na niekoľko cieľov, čo znižuje špecificitu, a zvyšuje potenciálne falošne pozitívne výsledky. Teplota žíhania (Tm) je rozhodujúcim faktorom pre stanovenie špecifickosti / presnosti postupu qPCR a je nevyhnutná pre hodnotenie presnosti protokolov qPCR. Odporúčanie podľa osvedčených postupov: Oba primery (priamy aj rezervný) by mali mať takmer podobnú hodnotu, najlepšie rovnakú hodnotu. Použili sme voľne dostupný softvér na návrh primerov Primer-BLAST na vyhodnotenie hodnôt najlepších postupov pre všetky primery použité v dokumente Corman-Drosten. Pokúsili sme sa nájsť hodnotu Tm 60°C, pričom sme podobne hľadali najvyššiu možnú hodnotu GC% pre všetky primery. Maximálny rozdiel Tm 2°C v pároch primerov sa považoval za prijateľný. Pri testovaní párov primerov uvedených v dokumente Corman-Drosten sme pozorovali rozdiel 10°C vzhľadom na teplotu žíhania Tm pre pár primerov 1 (RdRp_SARSr_F a RdRp_SARSr_R). Toto je veľmi vážna chyba a robí protokol nepoužiteľným ako špecifický diagnostický nástroj.

Dodatočné testovanie preukázalo, že iba pár primerov určený na zosilnenie N-génu (N_Sarbeco_F a N_Sarbeco_R) dosiahol adekvátny štandard na vykonanie diagnostického testu, pretože má dostatočný obsah GC a rozdiel Tm medzi primermi (N_Sarbeco_F a N_Sarbeco_R) je 1,85°C (pod rozhodujúcim maximom rozdielu 2°C). Dôležité je, že ide o gén, ktorý nebol testovaný ani vo vzorkách vírusu, ani zdôraznený ako potvrdzujúci test. Okrem vysoko variabilných teplôt topenia a degenerovaných sekvencií v týchto primeroch existuje ďalší faktor ovplyvňujúci špecifickosť postupu: dNTP (0,4uM) sú dvakrát vyššie, ako sa odporúča pre vysoko špecifické zosilnenie. K reakcii sa tiež pridal ďalší síran horečnatý. Tento postup v kombinácii s nízkou teplotou žíhania môže vytvoriť nešpecifické zosilnenie. Ak je pre qPCR potrebný ďalší horčík, mala by sa ďalej preskúmať špecificita testu. Tu opísané chyby návrhu sú také závažné, že je vysoko nepravdepodobné, že dôjde k špecifickému zosilneniu genetického materiálu SARS-CoV-2 pri použití protokolu Corman-Drosten.

3.  Počet zosilňovacích cyklov:

Je potrebné poznamenať, že v dokumente Corman-Drosten nie je nikde zmienka o pozitívnom alebo negatívnom teste alebo o tom, čo definuje pozitívny alebo negatívny výsledok. Tieto typy virologických diagnostických testov musia byť založené na SOP vrátane validovaného a stáleho počtu cyklov PCR (hodnota Ct), po ktorých sa vzorka považuje za pozitívnu alebo negatívnu. Maximálna primerane spoľahlivá hodnota Ct je 30 cyklov. Nad Ct 35 cyklov je potrebné očakávať rýchlo rastúci počet falošne pozitívnych. Údaje PCR vyhodnotené ako pozitívne po Ct hodnote 35 cyklov sú úplne nespoľahlivé. Citujúc Jaafar a kol. 2020: „Pri Ct = 35, ako hodnota, ktorú sme použili na hlásenie pozitívneho výsledku pre PCR, je pozitívnych <3% kultúr.“ Inými slovami, pri týchto vysokých hodnotách Ct nedošlo k úspešnej izolácii vírusu SARS-CoV-2.

Vedecké štúdie ďalej ukazujú, že s nekontrolovateľnými (mŕtvymi) vírusmi sa detegujú hodnoty Ct 35. Medzi 30 a 35 je sivá oblasť, kde nie je možné s istotou stanoviť pozitívny test. Táto oblasť by mala byť vylúčená. Samozrejme by bolo možné vykonať 45 cyklov PCR, ako sa odporúča v protokole WHO Corman-Drosten, ale potom je nutné taktiež definovať primeranú hodnotu Ct (ktorá by nemala presiahnuť 30). Avľak, analytický výsledok s hodnotou Ct 45 je vedecky a diagnosticky absolútne nezmyselný (rozumná hodnota Ct by nemala presiahnuť 30). Toto všetko by malo byť komunikované veľmi jasne. Je významnou chybou, že dokument Corman-Drosten neuvádza maximálnu hodnotu Ct, pri ktorej je možné vzorku jednoznačne považovať za pozitívny alebo negatívny výsledok testu. Táto dôležitá hraničná hodnota cyklu tiež nie je k dnešnému dňu uvedená v žiadnom následnom podaní.

4.  Biomolekulárne validácie:

Na určenie, či sú zosilnené produkty skutočne gény SARS-CoV-2, je nevyhnutná biomolekulárna validácia zosilňovaných produktov PCR. Pre diagnostický test je táto validácia absolútnou nevyhnutnosťou. Validácia produktov PCR by sa mala vykonať buď tak, že sa produkt PCR nechá bežať v 1% agarózo-EtBr gély spolu s indikátorom veľkosti (merač DNA alebo rebríček DNA), aby bolo možné odhadnúť veľkosť produktu. Veľkosť musí zodpovedať vypočítanej veľkosti produktu zosilnenia. Avšak, ešte lepšie je sekvenovať zosilnený produkt. Posledné uvedené poskytne 100% istotu o totožnosti produktu zosilňovania.

Bez molekulárnej validácie nie je možné spoliehať sa na totožnosť zosilnených produktov PCR. Vzhľadom na vyššie popísané závažné chyby návrhu môžu byť zosilnené produkty PCR čokoľvek. V dokumente Corman-Drosten sa neuvádza ani prípad malých fragmentov qPCR (okolo 100 bp): Môže to byť buď 1,5% agarózový gél alebo dokonca akrylamidový gél. Skutočnosť, že tieto produkty PCR neboli validované na molekulárnej úrovni, je ďalšou pozoruhodnou chybou protokolu, takže akýkoľvek test na ňom založený je nepoužiteľný ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

5.  Pozitívne a negatívne kontroly na potvrdenie / vyvrátenie špecifickej detekcie vírusu.

Nepotvrdený predpoklad popísaný v dokumente Corman-Drosten je, že SARS-CoV-2 je jediný vírus zo skupiny beta-koronavírusov podobných SARS, ktorý v súčasnosti spôsobuje infekcie u ľudí. Sekvencie, na ktorých je založená ich metóda PCR, sú in silico (teoretickými) sekvenciami dodanými laboratóriom v Číne, pretože v čase vývoja testu PCR nebol autorom k dispozícii žiadny kontrolný materiál infekčných („živých“) alebo inaktivovaných SARS-CoV- 2. Test PCR bol preto navrhnutý s použitím sekvencie známeho SARS-CoV ako kontrolného materiálu pre zložku Sarbeco (Dr. Meijer, spoluautor článku Corman-Drosten pri výmene e-mailov s Dr. Petrom Borgerom).

Všetci jedinci, ktorí majú pozitívny test RT-PCR, ako je opísané v dokumente Corman-Drosten, sa považujú za pozitívnych na infekcie SARS-CoV-2. V ich predpoklade sú tri závažné nedostatky. Po prvé, pozitívny test na molekuly RNA opísaný v dokumente Corman-Drosten sa nemôže rovnať „infekcii vírusom“. Pozitívny test RT-PCR iba indikuje prítomnosť molekúl vírusovej RNA. Ako je demonštrované v bode 1d (vyššie), Corman-Drostenov test nebol navrhnutý tak, aby detegoval vírus celej dĺžky, ale iba jeho fragment. Už sme dospeli k záveru, že to klasifikuje test ako nevhodný ako diagnostický test na infekcie vírusom SARS. Po druhé a najdôležitejšie je, že funkčnosť publikovaného testu RT-PCR sa nepreukázala pri použití pozitívnej kontroly (izolovaná RNA SARS-CoV-2), ktorá je nevyhnutným vedeckým zlatým štandardom. Po tretie, v dokumente Corman-Drosten sa uvádza: „Aby sme preukázali, že testy dokážu detegovať ďalšie vírusy súvisiace so SARS súvisiacimi s netopiermi, použili sme test génov E na testovanie šiestich fekálnych vzoriek odvodených od netopierov, ktoré sú k dispozícii od Drexler a kol. a Muth a kol. Tieto vírusovo pozitívne vzorky pochádzali z európskych nosorožcov. Detekcia týchto fylogeneticky odľahlých hodnôt v rámci kladu (skupina organizmov, ktoré sú monofyletické)CoV súvisiaceho so SARS naznačuje, že je pravdepodobné, že budú detegované všetky ázijské vírusy. To by teoreticky zabezpečilo širokú citlivosť aj v prípade viacnásobného nezávislého získavania variantných vírusov zo zásobníka zvierat.“

Toto tvrdenie demonštruje, že gén E použitý v teste RT-PCR, ako je opísaný v dokumente Corman-Drosten, nie je špecifický pre SARS-CoV-2. Primery génu E tiež detegujú široké spektrum ďalších vírusov SARS. Genóm koronavírusu je najväčší zo všetkých RNA vírusov, ktoré infikujú človeka, a všetky majú veľmi podobnú molekulárnu štruktúru. SARS-CoV1 a SARS-CoV-2 stále majú dva vysoko špecifické genetické odtlačky prstov, ktoré ich odlišujú od ostatných koronavírusov. Poprvé, v N-proteíne SARS-CoV a SARS-CoV-2 je prítomná jedinečná sekvencia odtlačkov prstov (KTFPPTEPKKDKKKK). Po druhé, SARS-CoV1, ani SARS-CoV2, neobsahujú proteín HE, zatiaľ čo všetky ostatné koronavírusy tento gén vlastnia. Aby bolo možné špecificky detegovať produkt PCR SARS-CoVl a SARS-CoV-2, mala by sa ako cieľ zosilnenia zvoliť vyššie uvedená oblasť v géne N.

Spoľahlivý diagnostický test by sa mal zamerať na túto špecifickú oblasť v géne N, ako potvrdzujúci test. V dokumente Drosten-Corman nebol PCR pre tento gén N ďalej overený, ani odporúčaný, ako testovací gén, pretože nebol „tak citlivý“ s pôvodnou sondou SARS-CoV. Okrem toho, absencia génu HE v SARS-CoVl a SARS-CoV-2 robí tento gén ideálnou negatívnou kontrolou na vylúčenie ďalších koronavírusov. Dokument od Corman-Drosten neobsahuje túto negatívnu kontrolu, ani neobsahuje žiadne ďalšie negatívne kontroly. Test PCR v dokumente Corman-Drosten preto neobsahuje ani jedinečnú pozitívnu kontrolu, ani negatívnu kontrolu, aby sa vylúčila prítomnosť ďalších koronavírusov. Toto je ďalšia veľká chyba v dizajne, ktorá klasifikuje test ako nevhodný na diagnostiku.

6.  Štandardný operačný postup (SOP) nie je k dispozícii:

Mal by byť k dispozícii štandardný operačný postup (SOP), ktorý jednoznačne špecifikuje vyššie uvedené parametre, aby všetky laboratóriá boli schopné nastaviť identické podmienky rovnakých testov. Získanie overeného univerzálneho SOP je nevyhnutné, pretože umožňuje porovnanie údajov v rámci krajín, aj medzi nimi. Je veľmi dôležité jednoznačne špecifikovať všetky parametre primeru. Poznamenávame, že sa tak nestalo. Ďalej, nie je uvedená hodnota Ct, ktorá indikuje, kedy sa má vzorka považovať za pozitívnu alebo negatívnu. Tiež nie je uvedené, kedy sa vzorka považuje za infikovanú vírusmi SARS-CoV. Ako je uvedené vyššie, test nedokáže rozlíšiť medzi vírusom a fragmentmi vírusu, preto je rozhodujúca hodnota Ct indikujúca pozitivitu. Táto hodnota Ct mala byť špecifikovaná v štandardnom operačnom postupe (SOP) a uvedená do režimu online, aby všetky laboratóriá vykonávajúce túto skúšku mali úplne rovnaké okrajové podmienky.

To, že taký SOP neexistuje, poukazuje na pochybný vedecký postup. Laboratóriá tak môžu vykonávať test podľa svojho uváženia, čo vedie k enormným zmenám. Laboratóriám v celej Európe zostáva veľa otázok; aké primery objednať? ktoré nukleotidy vyplniť na nedefinovaných miestach? ktorú hodnotu Tm zvoliť? Koľko cyklov PCR je potrebné spustiť? Pri akej hodnote Ct je vzorka pozitívna? A kedy je negatívna? A koľko génov treba testovať? Mali by sa testovať všetky gény, alebo len gén E a RpRd, ako je uvedené v Tabuľke 2 dokumentu Corman-Drosten? Mal by sa testovať aj N gén? A aká je ich negatívna kontrola? Aká je ich pozitívna kontrola? Popísaný protokol je, bohužiaľ, svojou koncepciou veľmi vágny a chybný, takže sa dá vydať desiatkami rôznych smerov. Zdá sa, že neexistuje žiadna štandardizácia, ani SOP, takže nie je jasné, ako je možné tento test implementovať.

7.  Dôsledky chýb popísaných v bodoch 1-5: falošne pozitívne výsledky:

Test RT-PCR opísaný v dokumente Corman-Drosten obsahuje toľko chýb molekulárno-biologického návrhu (pozri 1-5), že nie je možné získať jednoznačné výsledky. Je nevyhnutné, aby tento test generoval obrovské množstvo takzvaných „falošne pozitívnych“. Falošnú pozitivitu definujeme ako negatívnu vzorku, ktorá má spočiatku pozitívny výsledok, avšak ktorá je po opätovnom testovaní rovnakým testom negatívna. Falošne pozitívne výsledky sú chybné pozitívne výsledky testu, t. j. negatívne vzorky, ktoré majú pozitívny výsledok testu. A to je skutočne to, čo sa nachádza v dokumente Corman-Drosten. Na strane 6 originálu dokumentu vo formáte PDF autori demonštrujú, že aj pri dobre kontrolovaných laboratórnych podmienkach sa pri tomto teste generuje značné percento falošne pozitívnych:

„V štyroch jednotlivých testovacích reakciách bola pozorovaná slabá počiatočná reaktivita, pri opakovanom testovaní rovnakým testom však boli negatívne. Tieto signály neboli spojené so žiadnym konkrétnym vírusom a pre každý vírus, s ktorým sa vyskytla počiatočná pozitívna reaktivita, existovali ďalšie vzorky, ktoré obsahovali ten istý vírus vo vyššej koncentrácii, ale neboli pozitívne. Vzhľadom na výsledky rozsiahlej technickej kvalifikácie popísanej vyššie sa dospelo k záveru, že táto počiatočná reaktivita nebola spôsobená chemickou nestabilitou sond PCR v reálnom čase a najpravdepodobnejšie ide o problémy s manipuláciou spôsobené rýchlym zavedením nových diagnostických testov a kontrol počas tejto hodnotiacej štúdie.“

Prvá veta tohto výňatku je jasným dôkazom toho, že test PCR popísaný v dokumente Corman-Drosten generuje falošne pozitívne výsledky. Aj za dobre kontrolovaných podmienok najmodernejšieho laboratória Charité sú 4 z 310 primárnych testov podľa definície falošne pozitívne. Štyri negatívne vzorky boli pôvodne testované pozitívne, potom boli po opätovnom testovaní negatívne. Toto je klasický príklad falošne pozitívneho výsledku. V takom prípade ich autori neidentifikujú ako falošne pozitívne výsledky, čo je intelektuálne nečestné. Ďalším veľavravným pozorovaním v úryvku vyššie je, že autori vysvetľujú falošne pozitívne výsledky ako „problémy s manipuláciou spôsobené rýchlym zavedením nových diagnostických testov“. Predstavte si laboratóriá, ktoré musia zaviesť test bez všetkých nevyhnutných informácií, ktoré sú bežne opísané v SOP.

8.  Dokument Corman-Drosten nebol recenzovaný:

Pred formálnym uverejnením v odbornom časopise sú vedecké a lekárske články tradične certifikované prostredníctvom „recenzného hodnotenia“. V tomto procese sa redakcia časopisu radí s rôznymi odborníkmi („rozhodcami“), ktorí príspevok hodnotia, a môžu identifikovať nedostatky v jeho predpokladoch, metódach a záveroch. Časopis typicky uverejní článok až po tom, čo sa redaktori ubezpečia, že sa autori zaoberali obavami rozhodcov, a že predložené údaje podporujú závery vyvodené v článku. Tento proces je rovnako predpísaný aj pre články uverejňované v Eurosurveillance. Príspevok Corman-Drosten bol predložený do Eurosurveillance 21. januára 2020 a prijatý na zverejnenie bol 22. januára 2020. 23. januára 2020 bol príspevok online. 13. januára 2020 bola verzia 1-0 protokolu zverejnená na oficiálnych webových stránkach WHO, aktualizovaná 17. januára 2020, ako verzia dokumentu 2-1, ešte predtým, ako bol dokument Corman-Drosten zverejnený 23. januára v časopise Eurosurveillance.

Recenzné hodnotenie je zvyčajne časovo náročný proces, pretože minimálne dvaja odborníci z tejto oblasti musia kriticky prečítať a komentovať predložený príspevok. Podľa nášho názoru nebol tento príspevok recenzovaný. Dvadsaťštyri hodín jednoducho nestačí na vykonanie dôkladného preskúmania. Náš záver je podporený skutočnosťou, že sme našli obrovské množstvo veľmi závažných nedostatkov v dizajne, vďaka ktorým je test PCR úplne nevhodný, ako diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2. Každý molekulárny biológ, ktorý je oboznámený s návrhom RT-PCR, by pred skutočným procesom preskúmania ľahko spozoroval závažné chyby, ktoré obsahuje Corman-Drosten. 26. októbra 2020 sme požiadali Eurosurveillance, aby nám poslali kópiu správy z recenzného hodnotenia. Do dnešného dňa sme túto správu nedostali a v liste z 18. novembra 2020, ECDC ako hostiteľ systému Eurosurveillance, odmietlo poskytnúť prístup bez uvedenia závažných vedeckých dôvodov pre svoje rozhodnutie. Naopak, píšu, že „zverejnenie by ohrozilo účel vedeckých výskumov“.

9.  Autori ako redaktori:

Posledná vec je veľmi znepokojujúca. Ukazuje sa, že členmi redakčnej rady tohto časopisu sú aj dvaja autori článku Corman-Drosten, Christian Drosten a Chantal Reusken. Existuje teda vážny konflikt záujmov, ktorý posilňuje podozrenie, že príspevok nebol recenzovaný. Zdá sa, že rýchle uverejnenie bolo možné jednoducho preto, lebo autori boli tiež súčasťou redakčnej rady Eurosurveillance. Tento postup je kategorizovaný ako kompromitujúci vedeckú integritu.

Zhrnutie katalógu chýb zistených v článku

Článok od Corman-Drosten obsahuje nasledujúce konkrétne chyby:

1.  Neexistuje žiadny špecifikovaný dôvod na použitie týchto extrémne vysokých koncentrácií primerov v tomto protokole. Popísané koncentrácie vedú k zvýšeniu nešpecifických väzieb a zosilneniu produktov PCR, čo robí test nevhodným, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

2.  Šesť nešpecifikovaných vratkých polôh prináša obrovskú variabilitu v laboratórnych implementáciách tohto testu v reálnom svete; mätúci nešpecifický popis v dokumente Corman-Drosten nie je vhodný ako štandardný operačný protokol, vďaka čomu test nie je vhodný, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

3.  Test nedokáže rozlišovať medzi celým vírusom a vírusovými fragmentami. Test preto nemožno použiť ako diagnostiku intaktných (infekčných) vírusov, v dôsledku čoho je test nevhodný, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2 a na vyvodenie záveru o prítomnosti infekcie.

4.  Rozdiel 10°C vzhľadom na teplotu žíhania Tm pre pár primerov 1 (RdRp_SARSr_F a RdRp_SARSr_R) tiež robí test nevhodným, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

5.  Závažnou chybou je vynechanie hodnoty Ct, pri ktorej sa vzorka považuje za pozitívnu a negatívnu. Táto hodnota Ct sa nenachádza ani v následných prácach, ktoré robia test nevhodným, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

6.  Produkty PCR neboli validované na molekulárnej úrovni. Táto skutočnosť robí protokol nepoužiteľným, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

7.  Test PCR neobsahuje ani jedinečnú pozitívnu kontrolu na vyhodnotenie jeho špecifickosti pre SARS-CoV-2, ani negatívnu kontrolu na vylúčenie prítomnosti ďalších koronavírusov, čo znemožňuje vykonanie testu, ako špecifického diagnostického nástroja na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

8.  Návrh testu v dokumente Corman-Drosten je tak neurčitý a chybný, že sa dá vydať desiatkami rôznych smerov; nič nie je štandardizované a neexistuje SOP. To veľmi spochybňuje vedeckú platnosť testu a stáva sa nevhodným, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

9.  Dokument Corman-Drosten s najväčšou pravdepodobnosťou nebol recenzovaný, a aj preto test nie je vhodný, ako špecifický diagnostický nástroj na identifikáciu vírusu SARS-CoV-2.

10. Existuje závažný konflikt záujmov najmenej u štyroch autorov, okrem toho, že dvaja z autorov Corman-Drostenovej práce (Christian Drosten a Chantal Reusken) sú členmi redakčnej rady Eurosurveillance. Ďalší konflikt záujmov bol pridaný 29. júla 2020 (Olfert Landt je výkonný riaditeľ spoločnosti TIB-Molbiol; Marco Kaiser je vedúci výskumný pracovník v spoločnosti GenExpress, ktorý slúži ako vedecký poradca pre TIB-Molbiol), ktorý nebol vyhlásený v pôvodnej verzii (a vo verzii PubMed stále chýba); TIB-Molbiol je spoločnosť, ktorá „ako prvá“ začala vyrábať súpravy PCR (Light Mix) na základe protokolu zverejneného v dokumente Corman-Drosten, a podľa vlastných slov distribuovali tieto súpravy na testovanie PCR ešte pred vydaním publikácie; ďalej Victor Corman a Christian Drosten neuviedli svoje druhé prepojenie: komerčné testovacie laboratóriom „Labor Berlin“. Obaja sú zodpovední za tamojšiu diagnostiku vírusov a spoločnosť pracuje v oblasti testovania pomocou PCR v reálnom čase.

Na základe nášho opätovného preskúmania testovacieho protokolu na identifikáciu SARS-CoV-2 opísaného v dokumente Corman-Drosten sme identifikovali chyby a základné omyly, ktoré robia test SARS-CoV-2 PCR nepoužiteľným.

Záver

Rozhodnutie o tom, ktoré testovacie protokoly sú zverejnené a široko dostupné, leží priamo v rukách Eurosurveillance. Výhodou eventuálneho rozhodnutia o rozpoznaní zjavných chýb v dokumente Corman-Drosten by bolo výrazné minimalizovanie ľudských nákladov a utrpenia do budúcnosti. Nie je v najlepšom záujme Eurosurveillance stiahnuť tento dokument? Náš záver je jasný. Tvárou v tvár všetkým obrovským chybám a omylom v návrhu protokolu PCR, ktoré sú tu opísané, usudzujeme: V rámci vedeckej integrity a zodpovednosti nezostáva veľa možností na výber.“

  • Závery správy o preskúmaní dokumentu Corman-Drosten jednoznačne poukazujú na nepoužiteľnosť RT-PCR testov na hromadné testovanie. O RT-PCR sa pritom rovnako vyjadril aj ich vynálezca, Ken Mullis, keď sa vyjadril, že RT-PCR test nedokáže určiť, či je testovaný jedinec infekčný, alebo nie. Určenie infekčnosti je pritom jediným zmyslom testov na COVID-19. Ak totiž infikovaný jedinec vykazuje príznaky, aj bez vykonania testu je nútený podrobiť sa liečbe, čo zahŕňa aj domácu izoláciu. Ak človek dobrovoľne neabsolvuje liečbu v domácej izolácii pri chrípke, potom ju pravdepodobne neabsolvuje, ani ak mu ju nariadia kompetentné orgány po testovaní. Ide o mentalitu každého z nás. Práve infikovaný jedinec, ktorý nevykazuje príznaky chorenia, je nebezpečný pre spoločnosť, pretože bez vlastného vedomia môže šíriť nákazu ďalej. Tu je nevyhnutné pozastaviť sa nad rozdielom medzi pozitivitou a infekčnosťou. Byť automaticky pozitívny neznamená byť infekčný, t. j. schopný prenosu ochorenia na iného človeka. Neinfekčný jedinci nie sú nebezpečný pre spoločnosť, preto sa vraciame k téze, že zmyslom testovania je identifikácia infekčných jedincov a ich izolácia, najmä jedincov bez príznakov ochorenia.
  • Práve pre uvedené je určenie infekčnosti pravým a jediným zmyslom testov na COVID-19. Ak však RT-PCR nedokážu odpovedať na otázku, či je testovaný pozitívny jedinec infekčný, potom sú tieto testy zbytočné. RT-PCR sú pritom pre svoju citlivosť náchylné na vykazovanie pozitivity u infikovaných jedincov na omnoho dlhší čas, než trvá ich infekčnosť. Preto pri testovaní RT-PCR testami dochádza k izolácii jedincov, ktorých izolácia nie je pre spoločnosť potrebná. Zároveň, RT-PCR testy fungujú správne, ak sú nastavené na 25 až 30 cyklov. RT-PCR testy používané vo svete na testovanie COVID-19 sú však nastavené na väčší počet cyklov, ako je uvedené aj v správe o preskúmaní dokumentu Corman-Drosten. Uvedené je pritom ďalším dôvodom prečo RT-PCR testy vykazujú vysokú mieru falošnej pozitivity (97%), keďže pri svojom aktuálnom nastavení vykazujú pozitivitu aj v prípadoch, ak jedinec prišiel do styku s vírusom, avšak tento sa u neho nedokázal uchytiť, a teda tento jedinec reálne nie je infikovaný. Je preto veľmi nebezpečné nazývať RT-PCR testy zlatým štandardom a odvíjať od och výsledkom celosvetové či národné štatistiky šírenia ochorenia COVID-19 či odvíjať od nich iné metódy testovania.

Výkonnosť a špecificita antigénových testov

  • Európske centrum pre prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC) uverejnilo na svojom webovom sídle dňa 19.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Options for the use of rapid antigén tests for COVID-19 in the EU / EEA and the UK“ (Možnosti použitia antigénových rýchlotestov na COVID-19 v EÚ / EHP a Veľkej Británii):

„WHO odporúča antigénové rýchlotesty, ktoré spĺňajú minimálne výkonnostné požiadavky ≥ 80% citlivosti a ≥ 97% špecificisty, zatiaľ čo ECDC navrhuje zamerať sa na použitie testov s výkonnosťou bližšie RT-PCR, t.j. ≥ 90% citlivosť a ≥ 97% špecificita. Aby mohlo byť zariadenie uvedené na trh EÚ, musí výrobca preukázať dodržiavanie príslušných právnych požiadaviek smernice. To zahŕňa vykonanie vyhodnotenia výkonnosti zariadenia. U všetkých zariadení určených pre laického užívateľa, sa výrobca musí tiež obrátiť na orgán tretej strany (nazývaný aj ako notifikačný orgán), ktorý preskúma konštrukčné hľadiská zariadení a vydá príslušný certifikát. Pri zariadeniach pre COVID-19, určených výrobcom pre profesionálne použitie, požiadavka obrátiť sa na notifikačný orgán absentuje. Akonáhle výrobca deklaruje zhodu zariadenia s právnymi požiadavky, môže na zariadení umiestniť označenie CE a uviesť ho na trh. Označenie CE je teda založené prevažne na sebahodnotení (self-assessment) a vlastnom vyhlásení (self-declaration) výrobcu testu, vrátane tvrdení o výkonnosti testu, ku ktorým musí mať výrobca príslušnú technickú dokumentáciu a štúdie podporujúce tieto tvrdenia.

Nezávislé informácie o klinickej výkonnosti týchto testov, pokiaľ ide o citlivosť a špecificitu, sú často obmedzené, a napriek tomu sú pre správnu interpretáciu výsledkov zásadné. To je problémom najmä v súvislosti s rozvíjajúcou sa pandémiou. Vo svojom oznámení z 15. apríla 2020 a aj v najnovšom odporúčaní z 18. novembra 2020 Európska komisia odporučila, aby členské štáty pred zavedením zariadenia do klinickej praxe, vykonali overovacej štúdie. Výber testov, ktoré majú byť v národných systémoch zdravotnej starostlivosti použité, je na jednotlivých členských štátoch, ako súčasť ich národných právomocí v oblasti organizácie a poskytovania zdravotných služieb a lekárskej starostlivosti. Od 26. mája 2022 bude smernica nahradená nariadením (EÚ) 2017/7465. Nariadenie sprísni požiadavky na preukazovanie výkonu zariadení a zavedie dôkladné posúdenie testov na COVID-19, vrátane antigénových rýchlotestov, notifikačnými orgánmi.

Aktuálne údaje o výkonnosti a použití antigénových rýchlotestov – Iniciatíva Svetovej zdravotníckej organizácie FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics) poskytuje prehľad testov na SARS-CoV-2, ktoré sú komerčne dostupné, alebo sú vyvíjané pre diagnostiku COVID-19, vrátane údajov, či majú označenie CE. Ku dňu 11. novembra 2020 je v databáze FIND uvedených 56 antigénových testov s označením CE. Ako WHO, tak americký Úrad pre kontrolu potravín a liekov (FDA) poskytli zoznamy povolení pre núdzové použitie antigénových rýchlotestov. WHO uviedla dva antigénové rýchlotesty a FDA sedem antigénových rýchlotestov. ECDC vykonalo metaanalýzu klinickej výkonnosti komerčných testov na SARS-CoV-2, vrátane štyroch antigénových rýchlotestov, v období do 22. augusta 2020. Analyzovaním literatúry (predtlače a recenzovaných článkov, vrátane súkromných údajov od partnerov európskej siete laboratórií pre COVID- 19) o antigénových rýchlotestoch s označením CE, sme k 23. októbru 2020 získali ďalšie výsledky štúdií klinického hodnotenia, a to deviatich antigénových rýchlotestov od ôsmich spoločností.

V niekoľkých krajinách bolo, prevažne u symptomatických populácií, vykonané nezávislé hodnotenie. Hodnoty citlivosti a špecificity boli vypočítané porovnaním s testami RT-PCR a pohybovali sa medzi 29% (95% CI 15,7-42,3) a 93,9% (95% CI 86,5-97,4) pre citlivosť testu, a medzi 80,2% (95% CI 71,1-86,7) a 100% (95% CI 98,8-100) pre špecificitu testu. Výsledkom je, že väčšina antigénových rýchlotestov dostupných na trhu, je vyvinutá pre testovanie u symptomatických osôb a ich použitie u asymptomatických osôb sa v súčasnosti neodporúča.“

  • Európska komisia uverejnila na svojom webovom sídle dňa 18.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Commission recommendation of 18.11.2020 on the use of rapid antigen tests for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection“ (Odporúčania Komisie z 18.11.2020 k použitiu antigénových rýchlotestov pre diagnostiku infekcie SARS-CoV-2):

„Pokiaľ ide o možnosť použitia antigénových testov u asymptomatických osôb, je potrebné poznamenať, že v tejto súvislosti sú stále k dispozícii veľmi obmedzené údaje týkajúce sa výkonnosti antigénových rýchlotestov. U aktuálne dostupných antigénových rýchlotestov navyše pokyny výrobcov nezmieňujú asymptomatické osoby ako cieľovú populáciu.

  • Európske centrum pre prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC) uverejnilo na svojom webovom sídle dňa 11.6.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Diagnostic testing and screening for SARS-CoV-2“ (Diagnostické testovanie a skríning na SARS-CoV-2):

„Veľké množstvo komerčných detekčných testov RNA SARS-CoV-2 alebo antigénových a serologických testov na špecifické protilátky proti SARS-CoV-2 je uvádzané na trh alebo je potenciálne exportovateľné do krajín EÚ s značením CE-IVD. Informácie o ich klinických výsledkoch sú však stále obmedzené a prioritou je ďalšie vedecké overovanie ich diagnostickej presnosti, t. j. klinickej citlivosti a špecificity. To musí byť vykonané v prospektívnych kohortných štúdiách v reálnom živote na testovaných pacientoch alebo bežnej populácii. The Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), ako stredisko WHO pre spoluprácu na podporu laboratórií a hodnotenie diagnostických technológií, dostalo viac ako 600 žiadostí výrobcov o IVD, pričom na podskupine z nich vykonáva nezávislé klinické hodnotenie v niekoľkých nemocniciach spolupracujúcich s FIND. ECDC zbiera od 1. apríla 2020 údaje o klinickej výkonnosti komerčných testov od laboratórií členských štátov, ktoré sú ochotné tieto informácie zdieľať.“

  • WHO uverejnila na svojom webovom sídle dňa 11.9.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays“ (Detekcia antigénu v diagnostike infekcie SARS-CoV-2 pomocou rýchlych imunotestov):

„Prostredie vývoja diagnostických prostriedkov je dynamické a takmer stovka spoločností vyvíja alebo vyrába rýchle testy pre detekciu antigénu SARS-CoV-2. Daňou za jednoduchosť postupov rýchlych antigénových diagnostických testov (Ag-RDTs) je pokles citlivosti v porovnaní s testami zosilnenia nukleových kyselín (NAATI). Veľmi málo antigénových rýchlotestov na SARS-CoV-2 prešlo prísnou regulačnou kontrolou. Iba štyri testy dostali povolenie k núdzovému použitiu (EUA) od amerického Úradu pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) a ďalšie dva testy boli schválené Japonskou agentúrou pre farmaceutické a lekárske prístroje. Iba tri spoločnosti predložili dokumenty s cieľom zaradiť testy na Emergency Use Listing (EUL) WHO. Údaje o citlivosti a špecificite aktuálne dostupných antigénových rýchlotestov pre SARS-CoV-2 boli odvodené zo štúdií, ktoré sa líšia dizajnom a hodnotenými značkami testov. Ukázali, že sa senzitivita v porovnaní s testami NAATI vo vzorkách z horných dýchacích ciest (výtery z nosa alebo nosohltanu) javí ako veľmi variabilná, pohybujúca sa v rozmedzí 0-94% (4-13), ale špecificita je konzistentne uvádzaná ako vysoká (> 97%). Minimálne by antigénové rýchlotesty museli správne identifikovať významne viac prípadov, než koľko by ich nezachytili (citlivosť ≥ 80%) a mať veľmi vysokú špecificitu (≥ 97-100%).“

  • Ministerstva zdravotníctva ČR uverejnilo na svojom webovom sídle dňa 23.9.2020 odborné stanovisko Spoločnosti pre lekársku mikrobiológiu a Laboratórnej skupiny COVID MZ, v spolupráci s Národným referenčným laboratóriom SZÚ pre chrípku a nechrípkové respiračné vírusové ochorenia, s názvom „Priama detekcia SARS-CoV-2: detekcia antigénu“:

„Nevýhodou býva nižšia citlivosť testu. V súvislosti s diagnostikou COVID-19 sú skúsenosti s antigénovými testami v ČR zatiaľ obmedzené, ale z medzinárodnej odbornej literatúry vyplýva, že aj v tomto prípade platí, že antigénový test má nižšiu senzitivitu (uvádzanou väčšinou v rozmedzí 85 až 95%) v porovnaní s metódou PCR, ktorá je považovaná za zlatý štandard diagnostiky COVID-19. Antigénový test nemožno chápať ako rovnocenný ekvivalent PCR diagnostiky. Vôbec by nemal byť používaný ako skríningový k vyšetrovaniu jedincov s nízkou pravdepodobnosťou infekcie (t. j. napríklad u asymptomatického jedinca bez kontaktu s ochorením alebo pre skríning na letiskách či hraničných vstupoch). Výsledky je nutné interpretovať obozretne a v kontexte epidemiologickej situácie, obzvlášť potom pamätať na riziko falošnej negativity v oblastiach s vyššou prevalenciou ochorenia a na riziko falošnej pozitivity v oblastiach s nižšou prevalenciou ochorenia. Súprava pre detekciu antigénu SARS-CoV-2 musí mať CE IVD certifikáciu a súčasne deklarovanú citlivosť najmenej 90% a špecificitu najmenej 97%.

Využitie antigénových rýchlotestov je možné tak definovať pre nasledujúce situácie: 1) diagnostika COVID-19 u jedinca so závažnými príznakmi respiračného ochorenia, ktoré trvajú kratšiu dobu ako 3 dni, ak nie je k dispozícii možnosť prevedenia PCR v statimovom režime. Negatívny výsledok nevylučuje ochorenie COVID-19, a je tak nutné vykonať PCR pri pretrvávajúcom podozrení na COVID- 19. 2) diagnostika COVID-19 u jedinca s príznakmi respiračného ochorenia, ktoré trvajú kratšie ako 3 dni, ak nie je k dispozícii možnosť prevedenia PCR v bežnom režime (s výsledkom do 48 hodín). Negatívny výsledok nevylučuje ochorenie COVID-19. 3) diagnostické a epidemiologické testovanie pri lokálnom vzplanutí epidémie, ak nie je k dispozícii možnosť prevedenia PCR v bežnom režime.“

  • Státní zdravotní ústav ČR (SZÚ) uverejnil na svojom webovom sídle dňa 2.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom „Algoritmus použitia a interpretácie antigénového testu v detekcii choroby COVID-19 pre zariadenie dlhodobej lôžkovej starostlivosti, poskytovateľov sociálnych služieb v zariadeniach domovov pre osoby so zdravotným postihnutím, domovov pre seniorov a domovov so zvláštnym režimom a poskytovateľov sociálnych služieb poskytujúcim odľahčovacie služby v pobytovej forme“ (verzia platná od 2.11.2020): „Používajte antigénové testy (POC Ag) s certifikáciou CE IVD a s citlivosťou> 90% a špecificitou> 97%.“
  • V dňoch 21. – 24.10.2020 vykonali pracovníci Ústavu lekárskej mikrobiológie 2. LF UK a FN Motol, v spolupráci s odberovým miestom FN Motol, štúdiu porovnávajúcu dva typy antigénových testov s metódou PCR, s týmto záverom: „Výsledky štúdie sú naozaj ďaleko za očakávaním. Celková senzitivita antigénnych testov sa podľa nášho zistenia pohybuje pod hranicou 70%. Náš odhad bol pritom približne 85%“, hovorí prof. MUDr. Pavel Dřevínek, Ph.D., prednosta Ústavu lekárskej mikrobiológie 2. LF UK a FN Motol, a dodáva: „Dá sa povedať, že 3 z 10 Covid + pacientov, a to dokonca aj ak majú príznaky, antigénové testy vôbec nerozpoznajú.“
  • Spoločnosť Podané ruky uverejnila na svojom webovom sídle dňa 18.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom „Štúdia Spoločnosti Podané ruky ukazuje, že antigénne testy sú vysoko spoľahlivé“:

„Brno, 16. 11. 2020 – Spoločnosť Podané ruky v dňoch 5. a 6. novembra realizovala vo svojom prvom českom verejnom COVID test bode na brnenskom výstavisku odbornú štúdiu, ktorá mala porovnávať PCR testy a antigénové testy pri súbežnom testovaní na protilátky a štruktúrovanom dotazníku na anamnézu. Cieľom bolo zistiť spoľahlivosť antigénových testov a navrhnúť testovaciu metódu, ktorá môže byť následne uplatnená po celej republike. Výsledky štúdie preukázali, že antigénové testy sú vysoko spoľahlivou metódou na úrovni PCR. Veľmi presne dokážu odhaliť infekčného jedinca, čo je hlavným zmyslom testovania. Štúdia bola realizovaná na vzorke 96 ľudí. V 92 prípadoch nastala úplná zhoda. Údaje o pozitivite sa rozchádzali v dvoch prípadoch, keď vyšiel ako pozitívny len PCR test, a vo dvoch prípadoch, kedy vyšiel ako pozitívny antigénový test, ale PCR test vyšiel negatívne.“

  • Dva prípady, keď vyšiel antigénový test pozitívne, zatiaľ čo PCR test negatívne, autori vyhodnotili takto: „Ide pravdepodobne o správny pozitívny výsledok Ag testu a falošne negatívny výsledok PCR.“ To by znamenalo, že v dvoch prípadoch bol antigénový test citlivejší, ako metóda PCR, čo je veľmi zvláštne tvrdenie, pretože metóda PCR býva kritizovaná práve pre svoju nadmernú citlivosť, zatiaľ čo antigénový test pre svoju nízku citlivosť. Spoločnosť Podané ruky vo svojom článku ďalej uviedla:

Celkom 46 osôb (47,9%) uviedlo aspoň jeden príznak ochorenia COVID-19, najčastejšie u 27 osôb (28,1%) išlo o kašeľ. Celkom 40 osôb (41,7%) uviedlo, že bolo v posledných 7 dňoch v úzkom kontakte (t. j. na vzdialenosť 1,5 metra alebo menej počas aspoň 15 minút) s osobou preukázateľne infikovanou COVID-19. Celkom 68 osôb (70,8%) uviedlo klinické príznaky COVID-19 a /alebo kontakt s infikovanou osobou.“

  • Frekvencia jednotlivých sledovaných príznakov COVID-19 je nasledujúca: Telesná teplota 37,5 st. C a viac: 11 osôb (11,5%), kašeľ: 27 osôb (28,1%), strata chuti: 6 osôb (6,3%), strata čuchu: 11 osôb (11,5%), dýchavičnosť: 9 osôb (9,4%), zažívacie ťažkosti: 12 osôb (12,5%), iné: 13 osôb (13,5%).

„Pri prostom porovnaní s PCR testom dosahujú vlastnosti Ag testu iChroma II nasledujúcich hodnôt: Senzitivita 77,78%, špecificita 97,70%, pozitívna prediktívna hodnota 77,78%, negatívna prediktívna hodnota 97,70%, správnosť testu 95,83%. Po zohľadnení klinických a anamnestických údajov u prípadov s diskordantnými výsledkami (pozri vyššie) a zohľadnení pravdepodobnej falošnej negativity PCR testu vychádza vyhodnotenie validity Ag testu iChroma II, ako ukazuje nasledujúca tabuľka: Senzitivita 81,82%, špecificita 100,00%, pozitívna prediktívna hodnota 100,00%, negatívna prediktívna hodnota 97,70%, správnosť testu 97,92%.“

  • Štúdia bola vykonaná na analyzátore iChroma II, ktorý spoločnosť podľa svojich slov používa a distribuuje, preto je tu možnosť, že hodnotenie štúdie nebolo úplne objektívne:

„Spoločnosť Podané ruky už od začiatku septembra 2020 používa a distribuuje do ďalších sociálnych služieb a do firemného sektora analyzátory iChroma II (https://www.crp-ichroma.cz/), ktoré vyrába juhokórejská spoločnosť BODITECH Med.“

  • Vyššie uvedená štúdia teda bola vykonaná na vzorke 96 ľudí, z ktorých 7 ľudí malo pozitívny antigénne aj PCR test, 2 ľudia mali Ag + a PCR- a 2 ľudia mali Ag- a PCR +. Pri jednoduchom porovnaní antigénového testu s testom PCR bola hodnota senzitivity 77,78%, a hodnota špecificity 97,70%. Po zohľadnení klinických a anamnestických údajov u prípadov s diskordantnými výsledkami a zohľadnení pravdepodobnej falošnej negativity PCR testu autori uvádzajú hodnotu senzitivity 81,82%, a hodnotu špecificity 100,00%. Sledovanými príznakmi COVID-19 boli nešpecifické príznaky, ako kašeľ, zažívacie ťažkosti, telesná teplota 37,5 st. C a viac, strata čuchu, dýchavičnosť a strata chuti (zoradené zostupne podľa frekvencie výskytu príznakov), ktoré zďaleka nemusí spôsobovať len domnelý COVID-19. Hoci boli vyšetrené vzorky len od 96 ľudí, z ktorých pozitívne výsledky sa zistili len u 11 ľudí, Spoločnosť Podané ruky, na základe tejto štúdie, navrhuje vykonať tieto celoštátne opatrenia:

„Na základe vykonanej štúdie odporúča Spoločnosť Podané ruky vláde, aby bola po vzore Rakúska vytvorená celoštátna testovacia stratégia. Súčasne tiež odporúča ministrovi zahraničia, Tomášovi Petříčkovi, aby bola metóda antigénového testovania zavedená vedľa PCR pre prechody hraníc a navrhuje, aby Česko v tejto veci iniciovalo debatu v rámci Európskej únie. Štúdia bude v nasledujúcich dňoch pokračovať v spolupráci s Nemocnicou Milosrdných bratov.“

  • Jindřich Vobořil, riaditeľ Spoločnosti Podané ruky ďalej uviedol:

„Naše hlavné posolstvo a žiadosť je, aby štát pristúpil bezodkladne k masívnemu preventívnemu testovaniu na antigény a protilátky, pretože bez testovania čo možno najširšej časti populácie sa počas Vianoc, kedy sa zídu rodiny z celej republiky, vírus opäť rozšíri, a v kombinácii s postupným uvoľňovaním opatrení tu máme v priebehu januára tretiu vlnu. Iba dôsledné testovanie dokáže udržať situáciu pod kontrolou.“

  • 26.11.2020 boli na tlačovej konferencii predstavené výsledky štúdie porovnávajúcej 5 rôznych antigénových testov s metódou PCR a metódou viability vírusu. Štúdiu vykonala Nemocnica s poliklinikou Karviná-Raj spoločne so Zdravotným ústavom v Ostrave na zadanie Ministerstva zdravotníctva ČR. Celkovo bolo vyšetrených 1317 vzoriek. Zistené hodnoty senzitivity v 1. fáze testu (porovnanie metódy PCR a antigénnych testov): test 1: 61,9%, test 2: 76,2%, test 3: 58,4%, test 4: 41,1%, test 5: 70,1%. U 201 (15,3%) vzoriek, kedy bol výsledok antigénového testu rozdielny od výsledku testu PCR, bol vykonaný test viability. Výsledné hodnoty senzitivity, po zahrnutí výsledkov testu viability, boli: test 1: 86,7%, test 2: 97,7%, test 3: 92,9%, test 4: 80,9%, test 5: 87,9%. Výsledky špecificity v 1. fáze testu, po porovnaní s metódou PCR boli: test 1: 99,0%, test 2: 97,3%, test 3: 98,5%, test 4: 95,5%, test 5: 56,1% Po doplnení výsledkov testu viability boli hodnoty špecifickosti testov nasledujúce: test 1: 99,1%, test 2: 97,5%, test 3: 98,8%, test 4: 96,8%, test 5: 61,2%.
  • Bližšie informácie k tomu, akým spôsobom boli výsledky testu viability (ktorý bol vykonaný u 15,3% vzoriek) započítané do výsledkov, zistených v 1. fáze testu, bohužiaľ neboli uvedené. V 1. fáze (Porovnanie antigénnych testov s metódou PCR) bola priemerná hodnota senzitivity testov 61,54% a priemerná hodnota špecifickosti testu 89,28%. Po započítaní výsledkov testu viability bola priemerná hodnota senzitivity testov 89,22% a priemerná hodnota špecifickosti testu 90,68%. V prezentácii bohužiaľ neboli spomenuté ani údaje, ako podiel jedincov s príznakmi, zistené hodnoty Ct u metódy PCR, výsledky testu viability a porovnanie s hodnotami Ct, atď. Nebol spomenutý ani vplyv zistených hodnôt špecificity testu, teda aké budú, pri danej prevalencii ochorenia, hodnoty pozitívnej prediktívnej hodnoty (PPV), tzn. koľko percent výsledkov bude falošne pozitívnych.
  • Vedecký časopis ScienceMag uverejnil na svojich stránkach dňa 22.5.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „Coronavirus antigen tests: quick and cheap, but too often wrong?“ (Antigénové testy na koronavírus: rýchle a lacné, ale príliš často chybné?):

„Výsledkom je, že väčšina antigénnych testov má citlivosť niekde medzi 50% a 90% – inými slovami, jednému z dvoch infikovaných ľudí môže byť nesprávne povedané, že vírus nemá. Španielsky denník El Pais informoval, že minulý mesiac španielske zdravotnícke úrady vrátili tisíce antigénových testov na SARS-CoV-2 čínskej firme Shengzhen Bioeasy Biotechnology potom, čo zistili, že testy správne identifikovali infikovaných ľudí iba v 30% prípadov.“

  • Web American Society for Microbiology (Americká spoločnosť pre mikrobiológiu) uverejnil na svojom webovom sídle dňa 18.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom SARS-CoV-2 Testing: Sensitivity Is Not the Whole Story“ (Testovanie na SARS-CoV-2: Nejde tu len o citlivosť):

„Rýchle point-of-care antigénové testy na respiračné vírusy majú historicky špecificitu 98-99%, možno teda očakávať mieru falošnej pozitivity 1-2%. Pri použití testov vo veľkom meradle povedú aj malé nedokonalosti v špecificite testov k veľkému počtu falošne pozitívnych výsledkov. Ak je prevalencia infekcie nízka, bude veľká časť pozitívnych výsledkov falošne pozitívna. Ako sa nedávno ukázalo v kvalifikovaných ošetrovateľských zariadeniach v Nevade, môžu takéto aplikácie priniesť výsledky testov, ktoré budú mať za následok viac problémov ako úžitku. Pomocou výkonnostných charakteristík výrobcu pre test Abbott BinaxNOW COVID-19 sme modelovali percento testov, ktoré budú pozitívne, a výskyt falošne pozitívnych výsledkov pri rôznej miere prevalencie COVID-19.“

„Pri celoštátnej prevalencii 0,2% (na základe asymptomatických skríningových údajov z nemocníc a univerzít) bude každý 59. test pozitívny a 89% týchto výsledkov bude falošne pozitívnych. Ak by bol tento test použitý pre všetkých obyvateľov USA v jeden deň, bolo by približne 5,5 milióna pozitívnych výsledkov, z ktorých 4,9 miliónov by bolo falošne pozitívnych. Tieto falošne pozitívne výsledky možno potvrdiť pomocou druhého rýchlotestu, ale údaje o tomto postupe chýbajú. Alternatívne je možné potvrdzovacie testovanie vykonať v laboratóriu s certifikáciou CLIA pomocou vysoko presného molekulárneho testu EUA, čo by však mohlo spôsobiť nepríjemnosti, zmätok a oneskorenia pri čakaní na výsledky.

Údaje o výkonnostných charakteristikách antigénových testov u asymptomatických jedincov sú obmedzené. Aj keď veľa skupín hodnotí antigénové testy v rôznych podmienkach, ešte nie sú k dispozícii úplné údaje, ktoré by mohli poskytnúť informácie o tomto testovacom postupe k častému použitiu u asymptomatických populácií. Kým takéto údaje nebudú k dispozícii, nie je možné vedieť, či je časté používanie týchto testov u asymptomatických osôb vhodné.“

  • Časopis New York Times uverejnil na svojich stránkach dňa 8.10.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „Nevada halts use of rapid coronavirus tests in nursing homes, citing inaccuracies“ (Nevada zastavuje používanie rýchlotestu na koronavírus v opatrovateľských domoch z dôvodu nepresností):

„Spoločnosti BD (Becton Dickinson) aj Quidel pri podávaní žiadosti FDA (Úradu pre kontrolu potravín a liečiv) o núdzové povolenie deklarovali, že ich testy nevykazujú žiadne falošne pozitívne výsledky. Ale krátko potom, čo boli testy tento rok v lete po celom štáte zavedené, začali opatrovateľské domy hlásiť, že ľudia, ktorí boli hodnotení ako rýchlymi testami, tak aj pomalším, ale vysoko spoľahlivým laboratórnym testom zvaným P.C.R., dostávali protichodné výsledky. Z 39 pozitívnych výsledkov antigénového testu ako od BD, tak od Quidel, bolo 23 z nich testom P.C.R. vyhodnotené ako negatívne – chybovosť takmer 60 percent.“

  • Časopis The Guardian uverejnil na svojich stránkach dňa 13.11.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „Covid test for mass UK screening could miss up to half of cases, say scientists“ (Vedci tvrdia, že test pre hromadný skríning Covid vo Veľkej Británii by nemusel zachytiť až polovicu prípadov):

„Test s laterálnym tokom zakúpený britskou vládou pre plošné testovanie v Liverpoole a potenciálne v celej krajine, by podľa expertov nemusel zachytiť až polovicu z tých, ktorí majú Covid-19. Vláda má od testu Innova veľké očakávania, s kalifornskou spoločnosťou, ktorá za testom stojí, už podpísala dve zmluvy. Innova pre Guardian uviedla, že teraz do Veľkej Británie denne odosiela viac než milión testov. Ministerstvo zdravotníctva a sociálnej starostlivosti vo svojom vyhlásení uviedlo, že testy, ktoré sú teraz používané v Liverpoole, majú presnosť 99,6%. Zistenia z Public Health England Porton Down a Oxford University ukazujú, že novo nasadené testy s laterálnym tokom sú vysoko spoľahlivé, citlivé a presné v rôznych nastaveniach. U všetkých jedincov pozitívnych na PCR mali celkovú citlivosť 76,8%, ale detegovali viac ako 95% jedincov s vysokou vírusovou záťažou.

Profesor Jon Deeks, odborník na hodnotenie testov Covid-19, však s ich hodnotením presnosti nesúhlasil a vyhlásil, že by bolo nebezpečné používať testy na vylúčenie choroby. „Jedna skúška testov bola vykonaná v komunitnom testovacom centre, kde bolo detegované 58% prípadov Covid-19. Ďalšia zahŕňala skúsené zdravotné sestry testujúce ľudí v nemocnici, keď testy zachytili 73% prípadov Covid-19. Niektorí boli poslaní do Porton Down, kde testovaním zachytili 79%. Prvýkrát nám bolo umožnené vidieť údaje o výkonnosti testu, ktorý vláda zakúpila pre svoj plošný skríningový program Moonshot. Dáta DHSC ukazujú, že až polovica prípadov Covid nemusí byť testom zachytená a pri použití pri plošnom skríningu môžu vykazovať viac falošne pozitívnych výsledkov, než výsledkov skutočne pozitívnych“, uviedol. Profesor Sebastian Johnston z Imperial College London uviedol, že vládne oznámenie „budí dojem, že všetky antigénové testy s laterálnym tokom majú, po rozsiahlych klinických testoch vykonaných PHE / Oxford, vysokú citlivosť. To však má k pravde veľmi ďaleko.““

  • Časopis British Medical Journal uverejnil na svojich stránkach dňa 16.11.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „Mass testing for covid-19 in the UK“ (Plošné testovanie covid- 19 vo Veľkej Británii):

„Napriek tvrdeniam mestskej rady, že test Innova je „veľmi presný s vysokou citlivosťou a špecifickosťou“, nebol test za týchto podmienok hodnotený. Pokyny na použitie testu uvádzajú, že by sa nemal používať u asymptomatických osôb. Predbežné hodnotenie z Porton Down a Oxfordskej univerzity vrhá trochu svetla na jeho výkonnosť u asymptomatických ľudí alebo v teréne. Ukazuje, že test nezachytí jeden z dvoch až jeden zo štyroch prípadov. Miera falošne pozitívnych výsledkov 0,6% znamená, že pri súčasnej prevalencii v Liverpoole na každého človeka, ktorý bude uznaný skutočne pozitívnym, môže byť aspoň po jednom ďalšom človeku chybne vyžadovaná izolácia. S poklesom prevalencie to bude ešte oveľa horšie.“

  • Problém s falošnou pozitivitou testov sa objavil aj v domoch s opatrovateľskou službou vo Walese. V nižšie uvedenom článku nie je uvedený typ použitého testu, pravdepodobne ide o testy PCR. Všeobecne sa problémy s falošnou pozitivitou testov dajú aplikovať na akýkoľvek test.
  • Časopis The Brecon and Radnor Express uverejnil na svojich stránkach dňa 30.10.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „High rate of false positive coronavirus tests Causing growing alarm in Powys care homes“ (Vysoká miera falošne pozitívnych testov na koronavírus spôsobuje rastúce znepokojenie v domoch s opatrovateľskou službou v Powys):

„Prieskum Care Forum Wales, ktoré predstavuje takmer 500 nezávislých poskytovateľov opatrovateľských služieb, odhalil, že u 29,6% domov s opatrovateľskou službou vo Walese boli zaznamenané pozitívne výsledky, ktoré boli pri opakovanom testovaní negatívne. V skutočnosti vedúci starostlivosti hovoria, že miera falošne pozitívnych výsledkov ďaleko prevyšuje čísla z Welsh Government Technical Advisory Group, ktorá odhaduje deväť falošných testov na každých 1000 testov. Náš vlastný prieskum vyvoláva vážne otázky o platnosti a spoľahlivosti aktuálnych výsledkov, kedy takmer každý tretí domov s falošne pozitívnymi výsledkami núti zdravého zamestnanca a obyvateľov k zbytočnej izolácii. Pochopiteľne to medzi našimi členmi, ktorí reagovali hrdinsky na výzvy záchrany životov počas tejto pandémie, spôsobuje rastúce obavy, zmätok a frustráciu.“

  • Americký Úrad pre kontrolu potravín a liečiv (FDA) uverejnil na svojom webovom sídle dňa 3.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Potential for False Positive Results with Antigen Tests for Rapid Detection of SARS-CoV-2 – Letter to Clinical Laboratory Staff and Health Care Providers“ (Potenciál falošne pozitívnych výsledkov u antigénových testov pre rýchlu detekciu SARS-CoV-2 – list pracovníkom klinických laboratórií a poskytovateľom zdravotnej starostlivosti):

„FDA si je vedomý správ o falošne pozitívnych výsledkoch, spojených s antigénovými testami používanými v opatrovateľských domoch a iných zariadeniach, a naďalej sleduje a vyhodnocuje tieto správy a ďalšie dostupné informácie o bezpečnosti a výkonnosti testovacích zariadení. FDA upozorňuje pracovníkov klinických laboratórií a poskytovateľov zdravotnej starostlivosti na riziko falošne pozitívnych výsledkov u všetkých laboratórnych testov. Laboratóriá by mali očakávať výskyt možných falošne pozitívnych výsledkov, aj keď sa pre skríning veľkých populácií s nízkou prevalenciou infekcie používajú veľmi presné testy. Pri interpretácii výsledkov diagnostických testov pamätajte na to, že pozitívna prediktívna hodnota (PPV) sa líši v závislosti na prevalencii ochorenia. PPV je percento pozitívnych výsledkov testov, ktoré sú skutočne pozitívne. S poklesom prevalencie ochorenia sa zvyšuje percento falošne pozitívnych výsledkov testu. Napríklad test s 98% špecifickosťou by mal PPV niečo málo cez 80% v populácii s 10% prevalenciou, čo znamená, že 20 zo 100 pozitívnych výsledkov by bolo falošne pozitívnych. Rovnaký test by v populácii s 1% prevalenciou mal PPV iba asi 30%, čo znamená, že 70 zo 100 pozitívnych výsledkov by bolo falošne pozitívnych. To znamená, že v populácii s 1% prevalenciou má dané ochorenie v skutočnosti iba 30% jedincov s pozitívnymi výsledkami testu. Pri 0,1% prevalencii by PPV bola len 4%, čo znamená, že 96 zo 100 pozitívnych výsledkov by bolo falošne pozitívnych. Poskytovatelia zdravotnej starostlivosti by mali pri interpretácii výsledkov diagnostických testov brať miestnu prevalenciu do úvahy. Pozitívne výsledky posudzujte v kombinácii s klinickými pozorovaniami, anamnézou pacientov a epidemiologickými informáciami.“

  • Web Novinky.cz uverejnil na svojom webovom sídle dňa 2.11.2020 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Antigénové testy nezachytia tretinu pacientov“:

„Prof. MUDr. Pavel Dřevínek, Ph.D. na otázku „Znamená to teda, že na plošné testovanie, ako plánovalo ministerstvo zdravotníctva, by neboli tieto antigénové testy príliš vhodné?“ odpovedal: „Ponúka sa to. Je potrebné povedať, že antigénový test nie je koncipovaný ako test skríningový. Aj sami výrobcovia hovoria, že sa nemá používať bezhlavo. V príbalových letákoch k antigénovým testom sa dočítate, že sa majú používať u pacientov s príznakmi covidu-19. To má svoju logiku, pretože na získanie pozitívneho výsledku je potrebná pomerne vysoká vírusová nálož, ktorá je prítomná u príznakového pacienta. V súvislosti s diagnostikou je ešte dobré podotknúť, že antigénové testy nie sú v diagnostike infekčných ochorení žiadnou novinkou. Máme s nimi skúsenosti napríklad v diagnostike chrípky, kde sa v minulosti hojne používali, ale ich citlivosť sa pohybovala medzi 50-60 percentami. Nie je preto žiadne veľké prekvapenie, že aj antigénový test na nový koronavírus má citlivosť v tomto rozmedzí.“

  • Európske centrum pre prevenciu a kontrolu chorôb (ECDC) uverejnilo na svojom webovom sídle dňa 25.10.2016 nasledujúci článok k testom na COVID-19 s názvom Rapid Influenza Diagnostic Tests“ (Rýchle diagnostické testy na chrípku):

„Presnosť testu v porovnaní s referenčným testom („zlatý štandard“ = RT-PCR alebo kultivácia vírusu) – senzitivita rýchlotestu na chrípku je u rýchlotestov na chrípku všeobecne nízka až stredná (50-70%) – špecificita rýchlotestu na chrípku je u rýchlotestov na chrípku všeobecne veľmi vysoká (90-95%).“

  • Časopis Journal of Clinical Microbiology (Žurnál klinickej mikrobiológie) uverejnil na svojich stránkach dňa 21.10.2020 článok k testom na COVID-19 s názvom „Can We Test Our Way Out of the COVID-19 Pandemic?“ (Môžeme sa z pandémie COVID-19 dostať pomocou testovania?), ktorý sa zaoberá prípadným použitím lacných, rýchlych testov pre každodenné použitie (Lowsensitivity daily tests [LSDT]):

„Niektoré z vyvíjaných LSDT sú testy na báze detekcie antigénu. Niekoľko málo dostupných štúdií zistilo, že antigénové testy na SARS-CoV-2 majú vysokú špecificitu, ale štúdie všeobecne obsahovali relatívne malý počet vzoriek, čo sťažuje detekciu malých nedostatkov v špecificite týchto testov. Reálna špecificita antigénových testov môže byť významne nižšia, než ako naznačujú štúdie uskutočnené vyškolenými pracovníkmi laboratória, ako ukázal veľký klaster falošne pozitívnych antigénových testov vo Vermonte. Nie sme schopní nájsť údaje o špecifickosti pri testoch, ktoré na detekciu používajú LAMP a laterálny tok. Výkonnosť antigénových testov bola detailne hodnotená u iného respiračného vírusu – vírusu chrípky. Metaanalýza 159 štúdií, vrátane 26 rôznych antigénových testov na chrípku, zistila súhrnnú (pooled) citlivosť 62,3% (čo je dôvod, prečo mnoho laboratórií tento typ testu na chrípku opustilo) a súhrnnú (pooled) špecificitu 98,2%.

Nedávna publikácia o novšom antigénovom teste na chrípku so zlepšenou citlivosťou zistila špecificitu v rozsahu podobnom rozsahu zistenému vo vyššie uvedenej metaanalýze, 98,4%. Špecificita v rozmedzí 98% je typicky prijateľná (dokonca veľmi dobrá) pre použitie u pacientov s vysokou pravdepodobnosťou infekcie pred testovaním, ale pri použití v masovom meradle u asymptomatických subjektov má dôsledky aj mierne zníženie špecificity. napríklad ak by bola špecificita LSDT testov 98% a testy by každý deň použil každý z cca 325 miliónov ľudí v Spojených štátoch, potom by bolo každý deň ohromujúcich 6,5 milióna falošne pozitívnych výsledkov. V oblastiach krajiny s nízkou prevalenciou by veľmi veľká časť pozitívnych testov predstavovala falošne pozitívne výsledky. Ak vezmeme do úvahy dohľadávanie všetkých pozitívnych prípadov pomocou NAATI (testov zosilnenia nukleových kyselín), vo vyššie uvedenom príklade by počet potvrdzovacích testov, nutných vykonať každý deň, bol rádovo vyšší, ako súčasná národná kapacita (približne 650 000 testov denne). Ako by sme mohli očakávať, že široká verejnosť bude výsledky testu brať vážne a náležite na ne reagovať, ak test nebude citlivý a mnoho pozitívnych výsledkov bude chybných?

Ak by bola citlivosť nízka, ako sa od antigénových testov očakáva, a bolo by známe, že veľa pozitívnych výsledkov je falošne pozitívnych, výsledky by neboli všeobecne vierohodné a LSDT testy by pravdepodobne nedosiahli širokého použitia. Napríklad, ak by mal test citlivosť 80% a špecificitu 98%, pozitívna prediktívna hodnota (PPV) by pri 5% prevalencii bola 67,7% a negatívna prediktívna hodnota by bola 98,9%. Ak by sa však vyššie popísaný test použil v masovom meradle v oblastiach, kde je prevalencia nižšia ako 5%, čo bol zatiaľ pravdepodobne prípad väčšiny USA po väčšinu času počas pandémie, PPV by sa výrazne znížila: pri 1% prevalencii by PPV bola 28,8% a pri 0,1% prevalencii by PPV bola 3,8%.“

Závery medicínskych štúdií k RT-PCR testom a antigénovým testom

  • Z vyššie uvedených informácií vyplýva, že za použitia aktuálne dostupných vedeckých poznatkov nie je možné vytvoriť test, ktorým by bolo možné zaručene detegovať COVID-19. Kým totiž nebudú štandardnou vedeckou cestou izolované a preukázané genómy koronavírusu, budú sa ako základ pre detekciu COVID-19 používať rôzne laboratórne artefakty (umelo vytvorené genómy vírusu), ktoré síce môžu vykazovať podobnosť s genómami biologických štruktúr, ktoré by sa získali ich izoláciou, avšak nikdy nebudú skutočnými genómami skutočnej biologickej častice, a teda genómy koronavírus ostanú iba počítačovými modelmi laboratórnych artefaktov. Ak ostanú neidentifikované genómy koronavírusu, potom nebude možné ani vytvoriť test na detekciu prítomnosti koronavírusu v živom organizme. Postup „kultivácie“ používaný na preukázanie viability pritom zachytáva iba prípadný cytopatický efekt buniek v laboratórnych podmienkach bez toho, aby preukázal existenciu a prítomnosť hľadaného patogénu, preto nemôže byť použitý ako diagnostický postup pre diagnostiku COVID-19, resp. ako nástroj pre validáciu ostatných testov (t. j. nemôže byť použitý ako dôkaz o tom, že testovaný prišiel do styku s vírusom).
  • Ak by sme aj opomenuli takúto zásadnú skutočnosť, aktuálne sa na trhu objavuje veľké množstvo (nielen) antigénových testov k diagnostike COVID-19, ku ktorým sú často k dispozícii len obmedzené nezávislé informácie o klinickej výkonnosti testov, ako sú hodnoty citlivosti a špecificity. Tieto informácie sú však pre správnu interpretáciu výsledkov zásadné. Väčšina antigénových testov dostupných na trhu je vyvinutá pre testovanie symptomatických osôb a ich použitie u asymptomatických osôb sa v súčasnosti neodporúča. Európska komisia odporučila, aby členské štáty pred zavedením testov do klinickej praxe vykonali overovacie štúdie. Informácie o parametroch jednotlivých testov, ako je citlivosť a špecificita, zistené v praxi, sa objavujú postupne a v mnohých prípadoch vychádzajú horšie, než údaje udávané výrobcami.
  • Pre predstavu sme uviedli aj hodnoty u antigénových testov na chrípku, pri ktorých by mal byť dostatok údajov vzhľadom na dobu ich používania. Tento problém sa často spomína v súvislosti s citlivosťou testov. Bohužiaľ, údaje o špecifickosti testov sa nezmieňujú prakticky vôbec. Pritom dôsledky miery falošne pozitívnych výsledkov, najmä pri nízkej prevalencii ochorení v populácii, môžu byť veľmi zásadné. V praxi to znamená, že, zvlášť pri nízkej prevalencii ochorení, väčšina pozitívnych výsledkov bude falošne pozitívnych, teda že testy nesprávne označí zdravých jedincov ako pozitívnych. Na to nadväzuje povinná karanténa, dohľadávanie kontaktov, ich testovanie, možnosť nesprávnej liečby, prípadne hospitalizácia, navyšovanie štatistík pozitívnych prípadov COVID-19, prípadne počtov zomrelých s / na COVID-19, atď.
  • Pozitívne výsledky testov u asymptomatických osôb môžu byť spôsobené práve falošnou pozitivitou testov. Táto možnosť sa takmer vôbec nezmieňuje. Namiesto toho sa hovorí o asymptomatických nosičoch SARS-CoV-2, čo medzi ľuďmi vyvoláva strach z kontaktu s ostatnými ľuďmi, povinnosť nosenia rúšok a zavádzanie reštriktívnych opatrení. Lockdown a ďalšie reštriktívne opatrenia sa zdôvodňujú najmä vysokými počtami pozitívnych prípadov COVID-19. To, že grafy s počtom pozitívnych prípadov v podstate kopírujú grafy s počtami vykonaných testov, je evidentné. Čím viac sa testuje, tým viac pozitívnych prípadov je. Metóda PCR, absolútne nevhodná na detekciu údajných pôvodcov infekčných ochorení, so sebou nesie zásadný problémy, na ktorý sa už verejne upozorňuje, a proti zneužitiu tejto metódy sa už v zahraničí podnikajú právne kroky. K testovaniu pomocou metódy PCR sa postupne pridáva aj testovanie pomocou antigénových testov.
  • Hoci sa plošné testovanie asymptomatickej populácie pomocou antigénových testov neodporúča, v najbližšej dobe sa plánuje opäť hromadné testovanie populácie SR. Dá sa očakávať, že testovaní budú v úplnej väčšine ľudia bez príznakov. Pri nízkej prevalencii ochorení v populácii rastie riziko výskytu falošne pozitívnych výsledkov testov. Priemerná hodnota špecificity zistená v praxi hodnotením 4 antigénových testov (testov 1 – 4) v nemocnici v Karvinej, bola okolo 98% (ak nezapočítavajú test č. 5, u ktorého špecificita vyšla len okolo 60%). Keby napríklad klesla prevalencia ochorenia na 0,1% (chorý je 1 človek z 1000), tak pri testoch so špecifickosťou 98% by pozitívna prediktívna hodnota (PPV) bola iba 4%, teda 96 zo 100 pozitívnych výsledkov bude falošne pozitívnych. Žiadny test vo všeobecnosti nemá u všetkých vyšetrovaných vzoriek špecificitu 100% (hoci ju niektorí výrobcovia testov takto uvádzajú), preto bude každý test generovať určité percento falošne pozitívnych výsledkov.
  • Z samotného princípu testov teda počet pozitívnych prípadov nikdy nemôže klesnúť k nule. To sa samozrejme týka aj testov PCR. Aj keby sa v populácii dané ochorenie vôbec nevyskytovalo, tak test so špecifickosťou 98% bude stále generovať 2% falošne pozitívnych výsledkov. Je pravdepodobné, že k tejto situácii došlo pri plošnom testovaní na SR. V 1. kole testovania antigénovými testami bolo zistené 1,06% pozitívnych výsledkov, v 2. kole 0,66% pozitívnych výsledkov. Podľa príbalového letáku testu Standard Q COVID-19 Ag (SD Biosensor, Južná Kórea), použitého pri plošnom testovaní na SR, je hodnota špecificity 99.68% (95% 98.22 – 99.99%). Po overení v praxi ale napr. FIND uvádza klinickú špecificitu 99.3% (95% CI 98.6 – 99.6%), v štúdii uskutočnenej v Nemecku, a 97.6% (95% CI 95.2 – 98.8%) v štúdii z Brazílie.
  • Vyššie uvedené problémy s testovaním platia za hypotézy, že vírus SARS-CoV-2 spôsobuje ochorenie COVID-19. Ani to však do dnešného dňa nebolo vôbec preukázané. Údajný vírus SARSCoV- 2 nebol doteraz izolovaný a purifikovaný. Bez týchto nevyhnutných základných krokov nie je možné vytvoriť žiaden test (PCR, antigénový, ani test na protilátky, či iný test), ani vakcínu. To znamená, že žiaden z doposiaľ vykonaných testov po celom svete nedetegoval SARS-CoV-2, a preto sú všetky doteraz získané výsledky testov falošne pozitívne (aj tie výsledky testov, ktorých pozitivita bola následnými testami vyvrátená, aj tie výsledky testov, ktorých pozitivita bola následnými testami potvrdená). V nadväznosti na uvedené sú aj všetky doteraz vykonané reštriktívne opatrenia proti šíreniu údajného nového ochorenia COVID-19 absolútne neopodstatnené.
  • RT-PCR testy, ani antigénové testy teda nie sú spôsobilé na detekciu prítomnosti ochorenia COVID-19 u testovaného a potenciálnej možnosti prenosu tohto ochorenia na ďalšie osoby prostredníctvom testovaného, a to kvôli svojej vedeckej podstate fungovania. Preto by malo byť odporcovi zakázané erga omnes akceptovať výsledky RT-PCR testov a antigénových testov za predmetným účelom.

Záverečné zhrnutie

  1. RT-PCR testy a antigénové testy nie sú vhodné na zisťovanie prítomnosti ochorenia COVID-19 u testovaného a potenciálnej možnosti prenosu tohto ochorenia na ďalšie osoby prostredníctvom testovaného. Preto by sa mal štát zdržať používania RT PCR a antigénových testov a neakceptovať výsledky RT-PCR testov a antigénových testov za predmetným účelom, a teda aj vyžadovanie preukázania sa negatívnym výsledkom takéhoto testu slúžiaceho ako podmienka pre uplatnenie základných práv a slobôd.
  2. Testovanie človeka takýmito testami pritom spadá do oblasti pôsobnosti transplantačného zákona, keďže ide o odber tkaniva (hoci len výter z nosohltana), preto je na jeho vykonanie nevyhnutné vyžiadať si od testovaného informovaný súhlas. Nakoľko potrebnými informáciami ohľadom fungovania predmetných testov nedisponujú ani kompetentné orgány, asi iba ťažko dokážu poskytnúť predmetné informácie testovanému za účelom získania jeho informovaného súhlasu pred vykonaním testu. Testovanie RT-PCR testami a antigénovými testami je teda nie len neúčinné, ale ide aj o nehospodárne nakladanie s verejnými prostriedkami, pričom predmetná skutočnosť je hodná osobitného preskúmania.
  3. Vláda Slovenskej republiky nebola v nadväznosti na uvedené oprávnená vyhlásiť núdzový stav, nakoľko v čase jeho vyhlásenia, ani ku dnešnému dňu, nedisponuje ani len približnými informáciami o rozšírení ochorenia COVID-19 na území Slovenskej republiky, disponovanie ktorými je nevyhnutným predpokladom pre vyhlásenie núdzového stavu.
  4. V zmysle uvedeného nebola Vláda Slovenskej republiky oprávnená ani predĺžiť trvanie núdzového stavu. Okrem uvedeného nebola Vláda Slovenskej republiky oprávnená predĺžiť trvanie núdzového stavu aj z dôvodu vyššie uvedenej právnej analýzy, v zmysle ktorej je extenzívny výklad v rovine ústavného práva neprijateľný.
  5. Ak neboli splnené predpoklady v zmysle ústavného zákona č. 227/2002 Z. z. pre vyhlásenie, a ani pre následné predĺženie núdzového stavu, potom sú neúčinné aj všetky rozhodnutia a všetky predpisy prijaté na základe existencie núdzového stavu. Predmetné rozhodnutia a predpisy sú v nadväznosti na vyššie uvedenú právnu argumentáciu neúčinné aj z dôvodu, že Vláda Slovenskej republiky predmetnými rozhodnutiami a predpismi prijatými počas existencie núdzového stavu prekročila svoju právomoc, keď rozhodnutia a predpisy prijaté Vládou Slovenskej republiky počas existencie núdzového stavu, obmedzujú základné práva a slobody iným spôsobom, než to umožňuje Ústava Slovenskej republiky a ústavný zákon č. 227/2002 Z. z.
  6. Účelom článku nie je zľahčovať ani popierať existenciu patogénu. Je logicky aj empiricky zrejmé, že tu niečo na báze patogénu existuje a ľudí priamo ohrozuje. Treba však jedným dychom dodať, že vyššie uvedené zásadné chyby v izolácii patogénu majú logicky súvis aj s témou vakcinácie, ktorej sa budeme takisto venovať.

[1] Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2017/745 z 5. apríla 2017 o zdravotníckych pomôckach, zmene smernice 2001/83/ES, nariadenia (ES) č. 178/2002 a nariadenia (ES) č. 1223/2009 a o zrušení smerníc Rady 90/385/EHS a 93/42/EHS.

[2] Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2017/745 z 5. apríla 2017 o zdravotníckych pomôckach, zmene smernice 2001/83/ES, nariadenia (ES) č. 178/2002 a nariadenia (ES) č. 1223/2009 a o zrušení smerníc Rady 90/385/EHS a 93/42/EHS;

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2017/746 z 5. apríla 2017 o diagnostických zdravotníckych pomôckach in vitro a o zrušení smernice 98/79/ES a rozhodnutia Komisie 2010/227/EÚ.

[3] DRGONEC, J. Ústava Slovenskej republiky. Komentár. 3. vydanie Šamorín: Heuréka, 2012, 874 s.

Možnosti zdieľania článku

Similar Posts